ASTM A790 2507 / 2205 1.4462 / 1.4410 Tubeya Welded Duplex Ji bo Pîşesaziya Kîmyewî pêkhateya kîmyewî, Kêmasiya SPECC1L dibe sedema zêdebûna îstîqrara hevbendên şikestî û kêm rijandina şaneyên qirika nervê ya kranial.

Spas ji bo serdana Nature.com.Hûn guhertoyek gerokek bi piştgirîya CSS-ya sînorkirî bikar tînin.Ji bo ezmûna çêtirîn, em pêşniyar dikin ku hûn gerokek nûvekirî bikar bînin (an jî Moda Lihevhatinê ya di Internet Explorer de neçalak bikin).Wekî din, ji bo ku piştgirîya domdar misoger bike, em malperê bêyî şêwaz û JavaScript nîşan didin.

ASTM A790 2507 / 2205 1.4462 / 1.4410 Duplex Welded Tube Ji bo Pîşesaziya Kîmyewî

Liaocheng Sihe SS Material Co., Ltd.hilberînerek pêşeng e ku pispor e di lûleyên bêserûber polayê zengarnegir, lûleyên ronîkirî, lûleyên pêçandî yên bêserûber û hwd.Ji bo hêsankirina xerîdaran, me lûle û lûle jî weld kiriye.Liaocheng Sihe SS Material Co., Ltd.xwedan amûrên hilberîn û ceribandina herî pêşkeftî ye.Em dikarin bi tevahî hewcedariya we têr bikin.Li gorî standardek pir hişk, lûleyên ku ji hêla me ve têne hilberandin her gav xwedan tolerasyona OD û WT rast in.Kontrola toleransê bi hişkî li gorî standardan e.Berhemên me her gav ji xerîdar razî ne.Xerîdar hilberên me kirîn bêtir qezenc çêkirin.
a) OD (Diameterê Derve): 3.18mm ber 101.6mm
b) WT (Qûrahiya dîwar): 0.5mm heta 20mm
c) Dirêjî: Li gorî hewcedariya xerîdar
d) Standard: ASTM A312;ASTM A269;ASTM A789;ASTM A790 hwd
e) Rêbaza Pêvajoyê: ERW, EFW hwd

Sliders her slayd sê gotaran nîşan dide.Bişkojkên paş û paşê bikar bînin da ku di nav slaytan de bigerin, an jî bişkokên kontrolkerê slideyê yên li dawiyê bikar bînin da ku di her slaytê de bigerin.
Hucreyên qirika neuralî ya cranial (CNCC) ji pelikên neuralî yên embryonîk vediqetin û diçin kemerên farîngeal, yên ku piraniya strukturên navrûyê pêk tînin.Kêmasiya CNCC di etiolojiya qulika orofacial de, xeletiyek zikmakî ya hevpar de rolek girîng dilîze.Mutasyonên SPECC1L yên heterozîgot di nexweşên bi şikestinên atîpîk û sindromî de hatine dîtin.Li vir, em rengvedana pêşkeftî ya hêmanên girêdana birêkûpêk a kanonîkî (AJ), β-catenin û E-cadherin di şaneyên hilweşandî yên SPECC1L yên çandî de radigihînin, û mîkrografên elektronîkî belavbûna apical-basal a AJ-ê destnîşan dikin.Ji bo ku em rola SPECC1L di morfogeneza craniofacial de fam bikin, me modelek mişkek kêmasiya Speccc1l çêkir.Mutantên homozygous kujerên embrîyonî ne û girtina lûleya neuralî û lamînasyona CNCC astengdar nîşan didin.Rengkirina proteîna AJ di pelikên neuralî yên mutant de zêde dibe.Ev kêmasiya AJ-ê bi kêmasiyek di veqetandina CNCC de hevaheng e, ku jihevxistina AJ hewce dike.Wekî din, mutantên Specc11 nîşana PI3K-AKT kêm kirine û apoptosis zêde kirine.In vitro, astengkirina sivik a nîşankirina PI3K-AKT di hucreyên celeb-çovî de bes bû ku guheztinên AJ-ê çêbike.Ya girîng, guheztinên AJ yên ku ji hêla têkbirina SPECC1L ve têne çêkirin dikare bi çalakkirina riya PI3K-AKT vegere.Bi hev re, van daneyan destnîşan dikin ku SPECC1L, wekî rêgezek nû ya sînyala PI3K-AKT û biyolojiya AJ, ji bo girtina lûleya neuralî û stratejiya CNCC hewce ye.
Hucreyên qirikê neuralî yên kranîal (CNCC) li neuroektoderma dorsalê cih digirin û ji neuroepitheliumê pêlên neuralî yên pêşkeftî bi pêvajoyek ku veguheztina epîtelial-mesenchymal (EMT) 1,2,3 ve girêdayî ye, vediqetin.CNCC-yên epîtelyal ên pêşmigrarî girêkên navxaneyî diqetînin û dibin CNCC-yên mezenkîmal ên koçber ên ku kemerên farîngeal ên yekem û duyemîn tijî dikin û piraniya kartilaxa craniofacial pêk tînin.Ji ber vê yekê, genên ku fonksiyona CNCC birêkûpêk dikin bi gelemperî di etiolojiya anomaliyên zikmakî yên craniofacial de, yên wekî qulên orofacial, têne asteng kirin, ku bi gelemperî bandorê li 1/800 jidayikbûnê tenê li Dewletên Yekbûyî dikin.Yek ji deformasyonên zikmakî 8.
Dabeşkirina CNCC bi girtina lûleya neuralî ya pêşîn re di navbera 8,5 û 9,5 rojên pêşkeftina embryonîk de di mişkan de hevdem e.Mutantên hejmarek ji genên pêwendiya porê orofalî yên mişkî di heman demê de hin celeb kêmasiya lûleya nervê jî nîşan didin, di nav de Irf69,10, Ghrl310, Cfl111, û Pdgfrα12.Lêbelê, pêvajoyên girtina lûleya neuralî û stratejiya CNCC dikare serbixwe were hesibandin, ji ber ku mişkê mutant Splotch (Pax3) di girtina lûleya neuralî de kêmasiyan nîşan dide bêyî ku bandorek li ser stratejiya CNCC an koçberiyê bike 13,14.Modelên mişk ên din ên ku di veqetandina CNCC û girtina lûleya nervê de kêmasiyên wan hene dê bibin alîkar ku bingeha molekulî ya hevpar a van her du pêvajoyan diyar bike.
Veqetandina CNCC ji hucreyên neuroepithelial hewce dike ku jihevdekirina girêdanên adhesive (AJs), ku ji kompleksên proteîn ên ku di nav yên din de, E-cadherin, β-catenin, α-E-catenin, û α-actinin bi fîlamentên aktin 2 ve girêdayî ne, pêk tê. Lêkolînên derbirînê yên zêde E-cadherin di pelikên neuralî de kêmbûn an dereng di veqetandina CNCC de nîşan da.Berevajî vê, tepeserkirina E-cadherin dibe sedema stratejiya destpêkê15,16.Gelek faktorên ku navbeynkariya EMT dikin di dema stratejiya CNCC de faktorên veguheztinê ne (AP2α, Id2, FOXD3, SNAIL, TWIST, SOX10) û matrixa derveyî (ECM) proteînên nûvesazker ên wekî matrix metalloproteinases (MMPs), di heman demê de CNCC cytoskeletal rasterast in. hîn nayê zanîn.Rêya PI3K-AKT tê zanîn ku dijberî asta E-cadherin dike, nemaze ji lêkolîna penceşêrê17.Lêkolînên vê dawîyê destnîşan kirin ku windakirina nîşana PI3K-AKT-ya-based PDGFa di mişkan de dibe sedema anormaliyên craniofacial, di nav de kêmasiyên pal û lûleya neuralî12.Lêbelê, pêwendiya di navbera riya PI3K-AKT û aramiya AJ-ê de li ser stratejiya CNCC ne diyar e.
Me berê SPECC1L wekî gena yekem a mutant di du kesên ku bi şikestinek giran a ku ji dev heya çav dirêj dibe, nas kir, ku wekî şikila oblique (ObFC) an jî şika Tessier IV18 tê zanîn.Mutasyonên SPECC1L di du malbatên pir-nifşê de bi sendroma Opitz G/BBB ya otosom a serdest (OMIM #145410) hatine nas kirin, ku tê de kesên bandorbûyî hîperdistans û lêv/kaqê 19 nîşan didin, û di malbatek de bi sendroma zêdedûrbûna Tibi (OM4201 #24) .zêdetirî nîvê bûyerên sendroma Opitz G/BBB bi X-girêdayî ne (OMIM #300000) û ji ber mutasyonên di gena MID1 de, ku proteîna 22 ya îskeleta şaneya bi mîkrotubulê ve girêdayî ye, têne çêkirin.Em hîpotez dikin ku SPECC1L, di heman demê de proteînek ku bi mîkrotubulan û sîtoskeletonê aktînê ve girêdayî ye, dibe ku navbeynkariya îşaretkirina ku ji bo nûvekirina sîtoskeletonê aktîn di dema adhesion û koçberiyê de hewce dike bike 18.Di nav lêkolînên in vitro û in vivo de, em naha SPECC1L wekî rêgezek nû ya aramiya AJ-ê bi navgîniya nîşana PI3K-AKT ve diyar dikin.Di asta hucreyî de, kêmasiya SPECC1L bû sedema kêmbûna asta proteîna pan-AKT û zêdebûna belavbûna apical-basal a AJ, ku bi çalakkirina kîmyewî ya riya AKT-ê hate rakirin.Di vivo de, embrîyoyên kêmasiya Spec11 girtina lûleya neuralî astengdar nîşan didin û dabeşkirina CNCC kêm dikin.Ji ber vê yekê, SPECC1L di îşaretek pir birêkûpêk a girêdayîbûna hucreyê de ku ji bo fonksiyona CNCC ya normal di dema morfogeneza rû de hewce dike de dixebite.
Ji bo karakterîzekirina rola SPECC1L di asta hucreyî de, me xeta hucreya osteosarcoma ya domdar a ku berê hatî destnîşan kirin U2OS-ê ku di SPECC1L18 de kêmasî bikar anî.Van şaneyên U2OS-ê yên stabîl ên bi têkbirina SPECC1L (kd) kêmbûnek nerm (60-70%) di astên transkript û proteînên SPECC1L de, ligel kêmasiyên di koçkirin û ji nû ve organîzekirina sîtoskeletonê aktînê de hebûn 18. Berevajî vê, kêmbûnek demkî ya giran di SPECC1L hate destnîşan kirin ku dibe sedema kêmasiyên mîtotîk 23.Li ser karekterîzekirinek din, me dît ku şaneyên me yên SPECC1L-kd yên domdar morfolojî di astek pir zêde ya hevgirtinê de guheztin (Wêne 1).Hucreyên kontrolê yên takekesî û hucreyên kd yên li hevberdana kêm dişibin hev (Wêne 1A,D).24 demjimêran piştî hevgirtinê, şaneyên kontrolê şiklê xwe yê kuboîdal parast (Wêne. 1B, E), dema ku şaneyên SPECC1L-kd dirêj bûn (Hêjî. 1C, F).Rêjeya vê guherînê di şiklê hucreyê de ji hêla wênekêşiya zindî ya in vivo ya hucreyên kontrolê û hucreyên kd ve hate girtin (fîlm 1).Ji bo destnîşankirina rola SPECC1L di hucreyên tevlihev de, me pêşî li îfadeya wê lêkolîn kir.Me dît ku astên proteîna SPECC1L li ser hevgirtinê zêde bû (Wêne 1G), lê asta transkripta SPECC1L zêde nebû (Wêne 1H).Wekî din, her ku tîrêjiya şaneyê zêde bû, proteîna SPECC1L li sînorên navbera şaneyê (Hêjî. 2A-E) kom dibe, bi şêwazek ku bi ya β-catenin-a bi parzûnê ve girêdayî ye (Hêjî. 2A'-E').Ji ber ku têkiliya SPECC1L bi cytoskeleton aktin 18,23 re hate dayîn, me hîpotez kir ku SPECC1L bi girêdanên adhesive-based actin (AJ) re têkilî dike.
(AF) SPECC1L hucreyên knockdown (DF) li berhevdana bilind (F) li gorî hucreyên U2OS (AC) yên kontrolê dirêj dibin.Li vir sê ji şeş xalên demê (T1, T3, T6) têne xuyang kirin ku me ji bo dendikên hucreyên cihêreng hilbijartiye.(G) Analîza blota rojavayî ku destnîşan dike ku proteîna SPECC1L li gorî astek nizm a tevhevbûnê ya di hucreyên kontrolê de li astek bilind a hevgirtinê stabîl e.Blota rojavayî ya SPECC1L bendava 120 kDa ya çaverêkirî û bandek giraniya molekulê ya bilindtir nîşan dide, ku dibe ku ji hêla wergêranê ve hatî guheztin (*).Analîza blota rojavayî di heman şert û mercan de ji bo berhevkirina kêm û bilind hate kirin.Wêneyên ku SPECC1L li hevberdana kêm û bilind nîşan didin ji heman blotê hatine girtin.Heman blot hate rakirin û bi antîpota β-actin ji nû ve hate lêkolîn kirin.(H) Analîza RT-PCR ya hêjmarî di astên transkriptê yên SPECC1L de guhertinên girîng nîşan neda.Barên çewtiyê SEM-ê ji çar ceribandinên serbixwe temsîl dikin.
(AE) Me şeş xalên demê (T1-T6) hilbijart ku rêzek dakêşana hucreyê temsîl dike da ku analîza şeklê hucreyê û guhertinên AJ-ê di hucreyên U2OS-ê de bi têkbirina SPECC1L (kd) normal bikin.Di pênc xalên pêşîn ên van deman de şaneyên yekane (T1), 50-70% tevhevkirina komên xaneyên piçûk (T2), tevhevkirina bêyî şekilkirina şaneyên kd (T3), vesazkirina şaneyên kd (T4) û guhertinên 24 saetan hene.di forma paşiya şaneyên kd (T5).Proteîna SPECC1L bi giranî di nav sîtoplazmayê de li T1 (A) hate belav kirin, lê berhevkirina wê li ser sînorên navhucreyî di xalên demê yên paşîn de (B-E, tîr) hate dîtin.(FJ) β-catenin li sînorên intercellular ên ku bi kompleksa AJ-ê ve girêdayî ne berhevokek wekhev nîşan dide.(A'-E') SPECC1L û β-catenin li ser tixûbên hucreyê di dendika hucreyê ya bilind de (tîrên) rengdêra hevgirtî nîşan didin.(F'-J') Di şaneyên SPECC1L-kd de, rengkirina β-catenin di dendika şaneyê ya nizm (F'-H') de normal xuya dike, lê her ku şeklê şaneyê diguhere (I', J'; tîrên) berfireh dibe, û destnîşan dike ku AJ hatine guhertin.Bars = 10 μm.
Dûv re me hewl da ku bandora kêmasiya SPECC1L li ser AJ destnîşan bikin.Me gelek nîşangirên girêdayî AJ bikar anîn, di nav de pêkhateyên kanonîkî F-actin, myosin IIb, β-catenin, û E-cadherin24,25,26,27.Fîberên stresê yên Actin di hucreyên SPECC1L-kd de wekî ku berê hatî diyar kirin zêde bûn (Wêne. 3A,B) 18.Myosin IIb ku bi fîlmanên aktînê ve girêdayî ye, di şaneyên SPECC1L-kd de di vitro de zêdebûnek bi heman rengî nîşan da (Wêne. 3C,D).β-catenin-aJ-girêdayî bi kadherînê re li parzûna hucreyê ve girêdide, di kubosîtên kontrolê de şêwazek îfadeya "hingiv" ya normal nîşan dide (Wêne. 3E,G).Balkêş e, ku di wêneyên xêz de ku mîkroskopa konfokal bikar tînin, β-catenin (Wêne. 3E,F) û E-cadherin (Hêjî. 3G,H) li ser membrana hucreyê ya hucreyên kêmasiya SPECC1L-ê yên hevgirtî, qalibên berbiçav ên rengdêra dirêjkirî nîşan didin.Ev berbelavbûna rengdêra β-catenin a bi AJ-ê ve di şaneyên kd de herî zêde di hevgirtinê de diyar bû, lê xuya bû ku pêşî li guhertinên di şiklê hucreyê de digire (Wêne. 2F-J, F'-J').Ji bo destnîşankirina cewhera laşî ya vê dirêjkirina AJ-ê ya dirêjkirî, me sînorên hucreyê yên li ser rûyê apical-bazal ên hucreyên SPECC1L-kd U2OS bi mîkroskopa elektronîkî ya veguheztinê (TEM) vekolîn (Wêne 3I,J).Berevajî şaneyên kontrolê (Hêl. 3I), ku xwedan deverên elektronîk ên veqetandî yên AJ (tîr) bûn, şaneyên kd (Hêjê. 3J) deverên mezin û hevgirtî yên tîrêjiya elektronê ya bilind nîşan didin ku AJ li ser balafira apicobasal nîşan didin..Wekî din, li ser beşên gerguhêz, me di şaneyên kd de pelikên perdeya hucreyê yên berfireh (Hêjî. S1A, B) dîtin, ku ev şêwaza dirêjkirî ya bandên rengdêra β-catenin û E-cadherin rave dike (Wêne. 3F,H).Ji bo piştgirîkirina rola SPECC1L di AJ-yan de, β-catenin bi SPECC1L re di lîzên hucreyên U2OS yên hevgirtî de (Hêjîrêk 3K) re hevamunoprosipît kirin.Digel dirêjkirina immunostaining ji bo nîşankerên AJ, analîza TEM bi hîpoteza me re hevaheng bû ku kêmasiya SPECC1L tîrêj û cihêrengiya apical-basal AJ zêde dike.
(AH) Di şaneyên kd de di 48 demjimêran de piştî fusionê rengkirina F-actin zêde bû (T6; A, B).Rakirina guheztina myosin IIb bi F-actin (C, D) ve girêdayî ye.Di hucreyên kontrolê de (E, G) di hucreyên SPECC1L-kd (F, H) de şêwaza xweş a rengdêra membrana β-catenin û E-cadherin.Bars = 10 μm.(I–J) Elektronên mîkrografî yên ku li hevbenda navxaneyî ya apîk-bazal temaşe dikin.Hucreyên kontrolê deverên elektron-dûr ên cihêreng nîşan didin ku girêkên zeliqandî (I, tîr) destnîşan dikin.Berevajî vê, tevahiya hevbendiya apical-basal di şaneyên SPECC1L-kd de elektronek dendikê xuya bû (J, tîr), ku zêdebûn û belavbûna girêdanên adhesive nîşan dide.(K) β-catenin bi SPECC1L re di lîzên hucreya U2OS-ê yên hevgirtî de bi immunoprecipitated bû.Wêne ji yek deverek hatî girtin ku yek ji çar ceribandinên serbixwe temsîl dike.
Ji bo ku em rola SPECC1L di morfogeneza craniofacial de fam bikin, me modelek mişkek kêmasiya Speccc1l bi karanîna du xetên hucreyên xefikê yên ES yên serbixwe, DTM096 û RRH048 (BayGenomics, CA) afirand, ku transkrîptên intron 1 û Specc1l di 115 de hatine girtin (Fig. .4A, jimar S2).Cihê genomîk ê vektora deqê ji hêla rêzgirtina tevaya genomê ve hate destnîşankirin û bi PCR ve hate pejirandin (Wêne. S2).Her du sêwiranên xefika genê di heman demê de destûr da ku di çarçovê de hevgirtina nûçegihanên Specc11-lacZ piştî girtinê.Ji ber vê yekê, îfadeya lacZ-ê ku ji hêla rengkirina X-gal ve hatî destnîşankirin wekî nîşanek îfadeya Specc11 hate bikar anîn.Her du alel qalibên vegotina lacZ-ê yên wekhev nîşan dan, digel ku xefika genê DTM096 di întron 1 de ji RRH048 di întron 15 de (ne xuyangkirî) bi hêztir nîşan dide.Lêbelê, Spec1l bi berfirehî tête diyar kirin, bi taybetî bi vegotina xurt di pêlên neuralî de li E8.5 (Wêne 4B), di lûleya neuralî û pêvajoyên rû de li E9.5 û E10.5 (Wêne 4C,D), û di lingên pêşkeftî de. li E10.5 û çav (Wêne 4D).Me berê ragihandibû ku îfadeya SPECC1L di kevaneya farîngeal a yekem de li E10.5 di epithelium û mesenchyme18 de, bi rêza CNCC re heye.Ji bo ceribandina îfadeya SPECC1L di CNCC de, me qatên neuralî yên E8.5 (Wêne 4E-J) û beşên skull E9.5 (Wêne 4K-) pêk anîn.Li E8.5, SPECC1L qatên neuralî bi tundî reng da (Hêjî. 4E, H), di nav de şaneyên ku bi nîşankerên NCC hatine xemilandin (Wêne. 4G, J).Li E9.5, SPECC1L (Hêjî. 4K, N) CNCC-ya koçkirî ya bi AP2A (Hêjî. 4L, M) an SOX10 (Hêjî. 4O, P) hev-rengkirî bi xurtî reng kir.
(A) Nûnertiya şematîkî ya gena Speccc11 ya mişkî ku têketina vektora deqê di klonên hucreya ES DTM096 (intron 1) û RRH048 (intron 15) de nîşan dide.(BD) rengdêra lacZ a embrîyoyên heterozîgot Spec1lDTM096 ku îfadeya Speccc1l ji E8.5 heta E10.5 temsîl dikin.NE = neuroektoderm, NF = qata neuralî, PA1 = kevana farîngeal a yekem.(EP) SPECC1L immunostaining bi nîşankerên NCC AP2A û SOX10 li E8.5 (NF; EJ) paldankên neuralî û E9.5 (KP) beşên serjê.Rengkirina SPECC1L bi berfirehî di pelikên neuralî E8.5 (E, H; serê tîrê) de hate dîtin, di nav de şaneyên bi AP2A (F, G; serê tîran) û SOX10 (I, J; serê tîran) hatine nîşankirin.Di E9.5 de, SPECC1L CNCC-yên koçberkirî (K, N; tîrên) bi AP2A (L, M; tîr) û SOX10 (O, P; tîr) bi tundî reng kirin.
Derbasbûna di navbera mişkên heterozîgot Spec1lDTM096/+ û Spec1lRRH048/+ de nîşan dide ku her du alelên xefika genê temam nakin û ku heterozîgotên hevedudanî û homozygotên embryonîk ên ji bo her alelên xefika genê kujer in embryonîk (Table S1).Rêjeyên Mendelî kêmbûnek di rêjeya zindîbûna heterozîgotan de di zayînê de destnîşan kir (li bendê 1,34 ber 2,0).Me di nav heterozîgotan de mirina perinatal kêm destnîşan kir, hinan jî anomaliyên craniofacial hebûn (Wêne. S3).Lêbelê, pêketina kêm a van fenotipên craniofacial ên perinatal lêkolîna mekanîzmayên patofîzyolojîk ên wan ên bingehîn dijwar dike.Ji ber vê yekê, me bal kişand ser fenotîpa kujer a embryonîkî ya mutantên homozygous Speccc11.
Piraniya embrîyoyên mutant ên heterozîgot an homozîgot ên hevedudanî yên Spec1lDTM096/RRH048 piştî E9.5-10.5 pêşneketin (Wêne. 5A-D), û lûleya neuralî li pêş xwe negirt (Hêjî. 5B, D) û carinan jî li paş girtî (ne xuyang) ..Vê kêmasiya girtina lûleya neuralî ya kranialî bi piraniya CNCC-ya nîşankirî DLX2 re têkildar bû ku di E10.5 de di pelikên neuralî de dimîne, ku bê veqetandin nîşan dide (Wêne 5A'-D').Ji bo ku em diyar bikin ka mezinahiya giştî ya CNCC jî kêm bûye, me xetên CNCC bi GFP-ê di xetên xefika genê de bi Wnt1-Cre û ROSAmTmG etîket kir.Me GFP+ NCC û GFP- (RFP+) ne-NCC ji tevahî embrîyoyan veqetand.Di E9.5 de, rêjeya CNCC-yên nîşankirî yên GFP-ê-herikandinê di navbera WT û embrîyoyên mutant de (ne xuyangkirî) girîng neguherî, ku taybetmendiya CNCC ya normal destnîşan dike.Ji ber vê yekê, me hîpotez kir ku rengdêra mayî ya Wnt1-Cre û DLX2 di pelikên neuralî yên eşkerekirî de (Wêne 5B') ji ber xêzkirina CNCC ya xelet bû, dibe ku ji ber zêdebûn an belavbûna hucreyên AJ, wekî ku di hucreyên SPECC1L-kd de tê dîtin.Me nîşankerên NCC SOX10, AP2A, û DLX2 bikar anîn da ku hebûna CNCC di qata neuralî de piştrast bikin (Wêne 5E-R).Di E8.5 de, ji bo her sê nîşankerên NCC-ê rengdêra qatkirina neuralî di beşên WT (Hêjî. 5E, G, I) û mutantê Specc1l (Hêjî. 5F, H, J) de hate dîtin.Di E9.5 de, dema ku nîşankerên NCC NCC-ya koçber di beşên WT de reng kirin (Hêjî. 5M, O, Q), rengdêra mayî ya NCC di pelikên neuralî yên eşkerekirî yên embrîyoyên mutant Specc1l de hate dîtin (Wêne. 5N, P, R).Ji ber ku SOX10 û DLX2 CNCC-yên koçber nîşan didin, ev encam pêşniyar dike ku CNCC-yên kêmasiya SPECC1L bigihîjin taybetmendiya piştî-koçberiyê lê nekarin ji pelikên neuralî koç bikin.
Kêmasiya Specc11 dibe sedema girtina lûleya neuralî ya xelet, hilweşandina hucreyên qemera neuralî ya cranial û AJs.
(A, B') E9.5 WT (A) Embrîyona ku şaneyên qerta neuralî ya cranial koçkirî (CNCC) hildigire ku bi Wnt1-Cre (A') hatî nîşankirin.Berevajî vê, embrîyoyên mutant Specc11 pelikên neuralî yên vekirî (B), serê tîran) û CNCC-yên ku koç nekirine (B', serê tîrê) nîşan didin.(C, D') Wêneyên zeviyê ronî (C, D') û immunostaining (C', D') nîşana CNCC DLX2 ya embrîyoyên E10.5 WT (C, C') û Spec1l (D, D').Di embrîyoyên WT E10.5 de, CNCC-DLX2-erênî kemerên gilover (C', tîr) kolonîze dike, di heman demê de di mutantan de, rengdêra berbiçav di pelikên neuralî yên vekirî (D', tîr) û di kemerên farîngeal ên yekem de (D'), berdewam dike, tîrên).) bi hin rengdêran (tîrên) ku delamînasyon û koçberiya nebaş a CNCC nîşan dide.ER) Beşên embrîyoyên mutant WT û Spec1l yên di qonaxên E8.5 (E-L) û E9.5 (M-R) de bi nîşankerên NCC SOX10 (E, F, M, N), AP2A (G, H,) hatin nîşankirin. O, P) û DLX2 (I, J, Q, R).Di E8.5 de, rengkirina NCC di beşên neuralî yên çolê (NF) û beşên mutant de hate dîtin.Hev-rengkirina SOX10 û β-catenin di E8.5 WT (K) û mutant (L) de zêdebûna rengkirina β-catenin li ser sînorên hucreyê yên di pelikên neuralî de eşkere kir.Di E9.5 de, rengdêra celebê çolê ya CNCC-yên koçber (M, O, Q) hate dîtin, dema ku di mutantan de, CNCC-yên nestratkirî pelikên neuralî yên vekirî (N, P, R) reng kirin.(S-Z) Vekolîna nîşankirina AJ-ê di beşên koronal ên embrîyoyên WT û Spec11DTM096/RRH048 de bi mutasyona E9.5.Di quncikê jorê yê rastê de balafirek beşê ya texmînî tê xuyang kirin.Di beşên tevnên mutant de, zêde rengkirina F-actin (S, T) û myosin IIb (U, V) hate dîtin.Mîna encamên in vitro yên di Xiflteya 3-ê de, di embrîyoyên mutant de, ji bo β-catenin (W, X) û E-cadherin (Y, Z) rengkirina membrana zêdekirî hate dîtin.(AA-BB) Mîkrografek elektronîkî ya beşa embrîyoyek çolê ku li derveyî sînorê şaneya apical-basal dinêre herêmek elektron-dûr a cihêreng nîşan dide ku girêkên zeliqandî (AA, tîr) nîşan dide.Berevajî vê, di beşên embrîyoyên mutant Specc11 (BB, tîr) de, tevheviya apicobasal elektronîk e, ku zêdebûn û belavbûna girêdanên adhesive nîşan dide.
Ji bo ceribandina hîpoteza xwe ya ku kêmbûna qatbûnê ji ber AJ-ya guhezbar e, me nîşankirina AJ-ê di pelikên neuralî yên eşkerekirî yên embrîyoyên mutant Specc1l de lêkolîn kir (Hêjî. 5S-Z).Me zêdebûnek di fîberên stresê yên aktînê de (Wêne. 5S, T) û hevdemî zêdekirina herêmîbûna rengkirina myosin IIB li ser fîberên aktîn (Hêjî. 5U, V) dît.Ya girîng, me li sînorên navbera hucreyê rengkirina β-catenin (Hêjî. 5W,X) û E-cadherin (Hêjî. 5Y,Z) zêde dît.Me di heman demê de rengvedana β-catenin ya NCC-ê di pelikên neuralî yên embrîyoyên E8.5 de jî lêkolîn kir (Wêne. 5K, L).Rengkirina β-catenin di pelikên neuralî yên mutant Specc1l de (Fig. 5L û K) bihêztir xuya bû, û destnîşan dike ku guhertinên AJ dest pê kirine.Di mîkrografên elektronîkî yên beşên serjê yên embrîyoyên E9.5 de, me dîsa li embrîyoyên mutant Specc1l li gorî WT (Hêjî. 5AA, BB û S1E-H) rengdêra elektron-dansî ya belavbûyî zêde dît.Bi hev re, ev encam encamên meya in vitro di hucreyên SPECC1L-kd U2OS de piştgirî dikin û destnîşan dikin ku rengdêra AJ a berbiçav di embrîyoyên me yên mutant de pêşî li stratejiya CNCC digire.
Ji ber têkiliya dijberî ya naskirî ya di navbera çalakiya AKT û aramiya E-cadherin de, 17,28 me tevlêbûna nîşana PI3K-AKT hîpotez kir.Wekî din, me di hin embrîyoyên meyên mutant de ku ji mirinê xilas bûn (<5%) di E9.5-10.5 de û li şûna wê li dora E13.5 (Hêjî. S3) bi cih bûn de, blisterên subepidermalî dîtin.Vezîkên subepidermal nîşanek kêmbûna nîşana PI3K-AKT-ê ya li ser bingeha PDGFRα12-ê ye.Fantauzzo et al.(2014) ragihand ku têkçûna aktîvkirina PI3K-a-based PDGFRa di embrîyoyên mutant PdgfraPI3K / PI3K de dibe sedema vezîkulên subepidermal, kêmasiyên lûleya nervê, û fenotîpên paleyê yên şikestî.Bi rastî, astên pan-AKT û Ser473-AKT-ya fosforîlekirî ya çalak di vivo de di tevnên mutant ên Specc1l de heya girtina embryonîk E9.5 kêm bûn (Hêjî. 6A-D).Kêmbûna astên Ser473-AKT-a fosforîlekirî bi tevahî ji ber kêmbûna astên pan-AKT in vivo (WÊN 6E) û in vitro (WÊN 6F) be.Kêmbûnek in vitro tenê dema ku hucreyên U2OS bi guheztinên di şeklê hucreyê û dendika AJ-ê de bi xurtî lihevhatî bûn (Wêne 6D) hate dîtin.Bi vî rengî, daneyên me destnîşan dikin ku SPECC1L di morfogeneza craniofacial de rêgezek erênî ya nû ya nîşana PI3K-AKT ye.
(A-E) E8.5 (A,B) û E9.5 (C,D) beşên serjê an lîzatên E9.5 ji embrîyoyên mutant Speccc1l (E) ku astên S473-AKT-ê fosforîlated aktîf û kêmkirina proteîna pan-AKT nîşan didin. , li gorî kontrola WT.Western blotting li ser lîzên çolê û lîzên mutant di bin heman şertan de hate kirin.Wêneyên ku ji bo SPECC1L têne xuyang kirin ji yek blotê hatine girtin.Heman blot hate rakirin û bi antî-pan-ACT û β-actin antîbodî ji nû ve hate lêkolîn kirin.Asta Pan-AKT di pelikên neuralî yên E8.5 (A, B) de û astên S473-AKT fosforylated di beşên skull E9.5 de bi girîngî kêm bûn.(F) Asta Pan-AKT bi heman rengî di lîzên hucreyên SPECC1L-kd U2OS de ku di berhevoka bilind de hatî berhev kirin de kêm bû.Barên çewtiyê SEM-ê ji sê hejmarên blota rojavayî yên serbixwe temsîl dikin.(GJ) Beşên embrîyoyên WT yên li E9.5 bi KI67 û kaspase 3 veqetandî, bi rêzê ve, belavbûna hucreyê (G, G') û çalakiya apoptotîk a piçûk (H, H') nîşan didin.Embriyonên mutant Specc11 berbelavbûna şaneyê ya berawirdî nîşan didin (I), lê hejmara şaneyên ku di apoptozê de derbas dibin bi girîngî zêde dibe (J).
Dûv re me nîşankerên belavbûn û apoptosis lêkolîn kir.Me di belavbûna embrîyoyên E9.5 de ti ferqek nedît (Hêjî. 6E, G li gorî I) bi îndeksa belavbûnê ya %82.5 ji bo mutantên WT û %86.5 ji bo mutantên Specc1l yên ku bi rengkirina KI67 têne pîvandin (p <0.56, Fisher's testa rastîn).Bi heman rengî, me di apoptoza ku bi rengkirina kaspase 3-ya şikestî ya li E8.5-ê de di pelikên neuralî de heya girtina embrîyoyê (ne xuyangkirî) ve hatî pîvandin, ti cûdahî nedît.Berevajî vê, apoptosis di hemî embrîyoyên mutant E9.5 de bi girîngî zêde bû (Wêne. 6F, H û J).Ev zêdebûna giştî ya apoptozê bi kêmbûna nîşana PI3K-AKT û mirina zû ya embryonîk re hevaheng e29,30,31.
Dûv re, ji bo piştrastkirina rola sedemek ji bo nîşankirina PI3K-AKT di guhertinên AJ-ê de di hucreyên me yên kd de, me riya kîmyewî di hucreyên kontrol û kd de guhezand (Wêne 7A-F).Me wekî nîşanker fenotîpa guheztina şeklê şaneyê ku di şaneyên SPECC1L-kd yên hevgirtî de tê dîtin, bikar anî, ku me bi rêjeya dirêjtirîn pîvana (dirêjî) bi pîvana vertîkal (firehiya) ve jimartin.Rêjeyek 1-ê ji bo şaneyên dor û kuboîdî yên nisbeten tê hêvî kirin (Wêne 7G).Ji bilî şeklê şaneyê, me bandora li ser AJ bi rengkirina β-catenin jî piştrast kir (Wêne. 7A'-F').Astengkirina riya PI3K-AKT bi karanîna wortmannin têr bû ku şeklê hucreyê di hucreyên kontrolê de biguhezîne (Wêne 7A,C) û AJ (Wêne 7A').Aktîvatorê PI3K-AKT SC-79 di hucreyên kontrolê de bandor li şeklê hucreyê (WÊN 7A, E) an berfirehkirina AJ (WÊN 7A') nekir.Di hucreyên SPECC1L-kd de, tepeserkirina bêtir rêça PI3K-AKT bû sedema zêdebûna apoptosis (Wêne. 7B, D) û zêdebûnek berbiçav a rengdêra β-catenin (Hêjî. 7B'), ku bi mutantên me yên giran ên in vivo re têkildar e.Ya girîng, çalakkirina rêça PI3K-AKT bi girîngî şeklê hucreyê (Wêne 7B,F) û fenotîpên AJ (Wêne 7B") çêtir kir.Guhertinên di şiklê hucreyê de wekî rêjeya dorbûna şaneyê (CCR) hatin hejmartin û ji bo girîngiya ku li jor hatî diyar kirin (WÊN 7G) hate berhev kirin.Bi rastî, di hucreyên kontrolê de (Hêjî. 7G, CCR = 1.56), dermankirina wortmannin bes bû ku bi girîngî şeklê hucreyê biguhezîne (Wêne. 7G, CCR = 3.61, p <2.4 × 10-9) bi qasî ya ku tê dîtin. li SPECC1L.-kd şaneyên (Hêjîrê. 7G, CCR = 3.46).Dermankirina wortmannin ya şaneyên SPECC1L-kd (Hêjî. 7G, CCR = 3.60, neguhêz) ji şaneyên kd yên nehatî derman kirin (Hêjî. 7G, CCR = 3.46, neguhêz) an şaneyên kontrolê yên bi wortmannin (Hêjîrê. 7G) ne girîngtir bû., CCR = 3,46, neguhêz) di heman demê de bandorê li dirêjbûna hucreyê dike (7G, CCR = 3,61, neguhêz).Ya herî girîng, aktîvatorê SC-79 AKT fenotîpa dirêjkirî ya hucreyên SPECC1L-kd vegerand (Hêjî. 7G, CCR = 1.74, p <6.2 × 10-12).Van encaman piştrast dikin ku SPECC1L sînyala PI3K-AKT birêkûpêk dike û destnîşan dikin ku kêmbûnek nerm a SPECC1L bandorê li ser girêdana hucreyê dike, dema ku kêmbûnek xurt dibe sedema apoptosis (Hêjî. 8).
(A-F') Kontrol (A, C, E) û hucreyên SPECC1L-kd (B, D, F) yên ku bi astengkerê rêça PI3K-AKT wortmannin (C, D) an çalakkerê SC-79 (E, F) ve têne derman kirin. .Xaneyên kontrolê yên nehatine dermankirin kuboîdî ne (A) bi rengdêra şaneyên β-catê yên normal (A'), lê şaneyên kd dirêjkirî ne (B) bi rengkirina β-cat (B') zêde dibin.Piştî tepisandina rêça PI3K-AKT, hucreyên kontrolê bi berfirehbûna β-cat (C') dirêj bûn (C), dema ku hucreyên kd dest bi apoptozê (D) kirin, mîna embrîyoyên me yên pir mutated û β-catek zehf zêde xuya dikin.rengkirin (D').Piştî aktîvkirina rêça PI3K-AKT, hucreyên kontrolê kuboîdî (E) man û xwedî rengkirina β-cat (E') normal bûn, dema ku hucreyên kd bi rengek girîng şeklê hucreyê (F) û rengkirina β-cat (F') nîşan dan. (G) Rêjeya guheztina şeklê hucreyê di (AF) de bi karanîna rêjeya dorbûna şaneyê (CCR) ya herî dirêj (dirêjî) û pîvana vertîkal a têkildar (firahî) bi karanîna nermalava MetaMorph ve hate pîvandin.Hucreyên SPECC1L-kd yên nehatî dermankirin (NT) (CCR = 3.46) ji şaneyên kontrolê pir dirêjtir bûn (CCR = 1.56, p <6.1 × 10-13).Astengkirina Wort ya rêça PI3K-AKT di hucreyên kontrolê de bes bû ku bibe sedema dirêjbûnek wusa di şiklê hucreyê de (CCR=3.61, p<2.4×10-9).Bi heman rengî, aktîvkirina AKT ji hêla SC-79 ve di hucreyên SPECC1L-kd de dirêjbûna hucreyê li astên kontrolê vegerand (CCR = 1.74, p <6.2 × 10-12).Dermankirina wortmannin a hucreyên SPECC1L-kd di apoptozê de zêde bû, lê di guherîna şeklê hucreyê de (CCR = 3.60) zêde zêde nebû li gorî kd nedermankirî (CCR = 3.46, ns) an şaneyên kontrolê yên bi wortmannin (3.61) yên ku di nav de têne dîtin.ns = ne girîng e.+/- Pîvana SEM ji bo 50 hucreyan têne xuyang kirin.Cûdahiyên îstatîstîkî bi karanîna T-testa Student hatin hesibandin.
(A) Nûneratiya şematîkî ya astengkirin û aktîvkirina riya PI3K-AKT ku bi rêzê ve di encama guhertin û rizgarkirina AJ de pêk tê.(B) Modela pêşniyarkirî ji bo stabîlkirina proteîna AKT-ê ji hêla SPECC1L ve.
CNCC-yên pêşîn hewcedarê lîza AJ-ê ne ku ji hucreyên neuroepithelial yên paşîn ên nervê veqetin1,15,32.Zêdebûna rengkirina pêkhateyên AJ û windakirina belavkirina asîmetrîk a apical-basal AJ di şaneyên kêmasiya SPECC1L de hem in vitro û hem jî di vivo de, digel nêzîkbûna laşî ya SPECC1L bi β-catenin re, destnîşan dike ku SPECC1L fonksiyonê dike da ku aramiya herêmî ya AJ bi rêkûpêk biparêze. masûlkeyên rêxistinê.cytoskeleton actin.Têkiliya SPECC1L bi sîtoskeletonê aktîn û β-catenin û zêdebûna hejmara fîlanên aktîn ên kondenskirî di nebûna SPECC1L de bi zêdebûna dîtbarî ya di dendika AJ re hevaheng e.Ihtimalek din ev e ku hejmareke zêde ya fîberên aktînê di hucreyên kêmasiya SPECC1L de dibe sedema guherînek di tansiyona navserokî de.Ji ber ku stresa hucreyî bandorê li dînamîkên AJ 33 dike, guheztinên voltajê dikarin AJ 34 bêtir belav bibin.Ji ber vê yekê her guhertin dê bandorê li qatên CNCC bike.
Wnt1 di pêlên neuralî yên destpêkê de ku hucreyên girêka neuralî çêdikin de tête diyar kirin.Bi vî rengî, şopandina rêza Wnt1-cre hem pêş- û hem jî koçber NCC35 nîşan dide.Lêbelê, Wnt1 di heman demê de klonên tevna mêjî ya dorsal jî ku ji pelikên neuralî yên destpêkê 35,36 hatine wergirtin nîşan dide, îhtîmal e ku rengkirina me ya mutantên E9.5 ji bo nîşankerên Wnt1 di pelikên neuralî yên vekirî de ne CNCC ye.Rengkirina meya erênî ya ji bo nîşankerên NCC AP2A û SOX10 piştrast kir ku pelikên neuralî yên eşkerekirî yên embrîyoyên mutant Speccc11 bi rastî CNCC dihewîne.Wekî din, ji ber ku AP2A û SOX10 nîşankerên NCC-ya koçkirina zû ne, rengdêra erênî destnîşan kir ku ev şaneyên CNCC yên paş-koçber in ku ji hêla E9.5-ê ve nekarin werin dabeş kirin.
Daneyên me destnîşan dikin ku rêziknameya molekular a AJ-ê ji hêla SPECC1L ve bi nîşana PI3K-AKT ve tête navgîn kirin.Nîşana AKT di hucre û tevnên kêmasiya SPECC1L de kêm dibe.Vedîtinên Fantauzzo et al.di morfogeneza craniofacial de ji bo nîşankirina PI3K-AKT rolek rasterast piştgirî dikin.(2014) destnîşan kir ku nebûna aktîvkirina sînyala PI3K-AKT-ya-based PDGFRa dibe sedema fenotîpek palatê ya şikestî.Em her weha destnîşan dikin ku astengkirina riya PI3K-AKT bes e ku AJ û şeklê hucreyê di hucreyên U2OS de biguhezîne.Li gorî dîtinên me, Cain et al.37 destnîşan kir ku birêkûpêkkirina jêr-yekeya PI3K α110 di hucreyên endothelial de dibe sedema zêdebûnek bi heman rengî di rengkirina β-catenin a percellular de, ku wekî zêdebûna "indeksa girêdanê" tê binav kirin.Lêbelê, di hucreyên endothelial de ku fîlimên aktîn jixwe pir organîzekirî ne, tepeserkirina riya PI3K-AKT di şeklek hucreyek winda dibe.Berevajî vê, hucreyên SPECC1L-kd U2OS rengek hucreyek dirêjkirî nîşan dan.Ev cûdahî dibe ku celebek hucreyê taybetî be.Dema ku tepisandina nîşana PI3K-AKT bi domdarî bandorê li cytoskeletonê aktîn dike, bandora li ser şeklê hucreyê ji hêla guheztinên tansiyonê ve ku ji ber guheztinên tîrêj û organîzasyona fîberên aktîn ên navendî ve têne destnîşan kirin.Di hucreyên U2OS de, me tenê guhertinên şiklê hucreyê wekî nîşanek guhertin û vegerandina AJ-kêmasiya SPECC1L bikar anî.Di encamê de, em hîpotez dikin ku astengkirina riya AKT-ê di kêmasiya SPECC1L de aramiya AJ zêde dike û delamination di CNCC de kêm dike.
Balkêş e, di nebûna SPECC1L de astên pan-AKT di vitro û in vivo de ji bilî astên 473-AKT fosforylated kêm bûn, ku rêziknameya nîşana PI3K-AKT di asta aramî an veguheztina proteîna AKT de pêşniyar dike.Genên SPECC1L û MID1, her du jî bi sendroma Opitz/GBBB ve girêdayî ne, proteînên ku mîkrotubulan stabîl dikin kod dikin 18,22.Mekanîzmaya ku SPECC1L û MID1 navbeynkariya stabilîzasyona mîkrotubulê dike bi tevahî nayê fêm kirin.Di mijara SPECC1L de, ev îstîqrar acetilasyona pêşkeftî ya binkomek mîkrotubulan 18 dihewîne.Mimkun e ku SPECC1L mekanîzmayek wekhev bikar tîne da ku proteînên din ên wekî AKT aram bike.Hat destnîşan kirin ku acetilasyona bermahiyên lîzînê di proteîna AKT de dibe sedema kêmbûna herêmîbûna membran û fosforîlasyonê38.Wekî din, ubiquitinkirina zincîra K63 li heman bermayiya lîzînê ya li ser AKT-ê ji bo cîhkirin û aktîvkirina wê ya membranê hewce ye39,40.Di nav çend faktorên ku bi proteînên SPECC1L re têkildar in, ku di cûrbecûr ekranên hevîrtirşkê du-hîbrîd de bi rêkûpêk bilind têne nas kirin, çar - CCDC841, ECM2942, APC û UBE2I43 - bi navgîniya ubiquitination an sumoylation ve di veguheztina proteîn an aramiyê de hatine têkildar kirin.SPECC1L dibe ku di guherîna piştî-wergerandinê ya bermahiyên lîzînê yên AKT de beşdar bibe, ku bandorê li aramiya AKT bike.Lêbelê, rola krîtîk a SPECC1L di cihbûn û aramiya proteîna AKT de dimîne ku were ronî kirin.
Kêmasiyên giran ên di îfadeya SPECC1L de di vivo de bûn sedema zêdebûna rengdêra nîşankerê AJ û xerabûna CNCC, û her weha zêdebûna apoptosis û mirina zû ya embryonîk.Raporên berê destnîşan kirin ku mutantên mişkî yên bi asta apoptozê zêde bûne bi kêmasiyên lûleya neuralî 44,45,46,47 û kêmasiyên craniofacial48 ve girêdayî ne.Pêşniyar kirin ku mirina hucreyê ya zêde di pelikên neuralî an kemerên farîngeal de dibe ku bibe sedema kêmbûna hejmarek şaneyên ku ji bo tevgera morfogenetîk a rast hewce dike 48,49,50.Berevajî vê, xetên hucreyên me yên kêmasiya SPECC1L bi kêmbûna xwerû ya SPECC1L tenê guheztinên AJ-ê bêyî delîlên mirina hucreyê zêde nîşan didin.Lêbelê, astengkirina kîmyewî ya rêça PI3K-AKT di van hucreyên Kd de bû sedema zêdebûna apoptosis.Ji ber vê yekê, kêmbûnek nerm di vegotin an fonksiyona SPECC1L de zindîbûna hucreyê misoger dike.Ev bi çavdêriya ku embrîyoyên mutant Specc11 yên nadir ên ku ji girtinê direvin li st.E9.5-dibe ku ji ber kêmbûna karbidestiya girtina genê-karibe lûleyên xwe yên neuralî bigire û paşê di pêşveçûnê de raweste, bi gelemperî bi kêmasiyên craniofacial (Wêne. S3).Di heman demê de bi vê yekê re hevaheng e ku kêmbûna embrîyoyên Specc1l heterozîgot bi anormaliyên craniofacial-dibe ku ji ber zêdebûna karîgeriya girtina genê-û her weha vedîtina li masiyên zebra ku tê de yek ji du ortolojên SPECC1L (specc1lb) dibe sedema windakirina fenotîpên dereng embrîyonî. çenên jêrîn û şikeftên dualî51.Ji ber vê yekê, mutasyonên windabûna fonksiyonê ya SPECC1L ya heterozygous ku di nexweşên mirovan de têne nas kirin dibe ku di dema morfogeneza craniofacial de bibe sedema kêmasiyên piçûk di fonksiyona SPECC1L de, ku têra ravekirina qulên orofacial wan e.Rêziknameya SPECC1L-ya têkiliyên navbera hucreyî jî dibe ku di palatogenesis û hevgirtina kemerên farîngeal de rolek bilîze.Lêkolînên din ên fonksiyona SPECC1L dê alîkariya ronîkirina rola têkiliyên navhucreyî yên demkî yên li CNCC di dema girtina lûleya neuralî de di tevgera hucreya neuroepithelial û morfogeneza craniofacial de bike.
Kontrola osteosarcoma U2OS û hucreyên SPECC1L-kd berê hatine vegotin (Saadi et al., 2011).Antîkorên li dijî SPECC1L jî berê hatine diyar kirin (Saadi et al., 2011).Antîkorên dijî-β-catenin (rabbit; 1:1000; Santa Cruz, Dallas, TX) (mişk; 1:1000; Teknolojiya Signaling Cell, Danvers, MA), myosin IIb (1:1000; Sigma-Aldrich, St. Louis ) , MO) ), E-cadherin (1:1000; Abkam, Cambridge, MA), AP2A (1:1000; Novus Biologicals, Littleton, Colo.), SOX10 (1:1000; 1000; Aviva Systems Biology, San Diego , California), DLX2 (1:1000; Abcam, Cambridge, MA), phospho-Ser473-AKT (1:1000; Teknolojiya Signaling Cell, Danvers, MA), pan-AKT (1:1000; ThermoFisher Scientific, Waltham, MA ) , KI67 (1:1000; Teknolojiya Signaling Cell, Danvers, MA), kaspase 3 veqetandî (1:1000; Teknolojiya Signaling Cell, Danvers, MA) û β-actin (1:2500; Sigma-Aldrich, St. MO) wekî ku hatî destnîşan kirin hate bikar anîn..Fîlmên Actin bi Acti-stain rhodamine phalloidin (Cytoskeleton, Denver, Colorado) hatin reng kirin.
Hucreyên kontrolê yên U2OS û hucreyên SPECC1L-kd di DMEM-a standard a glukozê ya bilind de ku bi 10% seruma bezê fetusê ve hatî zêdekirin (Life Technologies, Carlsbad, CA) hatin çandin.Ji bo guhertinên AJ, 2 x 105 şaneyên li ser cama ku bi 0,1% gelatîna beraz (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) hatî derman kirin hatin çandin û ji bo guhertinên di şiklê hucreyê de hate dîtin.Xane di xalên dema diyarkirî yên cihê de hatin berhev kirin: 4 demjimêran piştî tovkirinê (t = 1), 24 demjimêran piştî tovê (t = 2), lihevhatina bêyî guheztina şeklê şaneyê (t = 3), guheztina şeklê xaneyê (t = 4) , 24 saet piştî guherandina şeklê şaneyê (t = 5) û 48 saet piştî guheztina şeklê xaneyê (t = 6) (Hêl. 1, 2, 3).Ji bo modulkirina riya PI3K-AKT, şaneyên li ser hûrgelên destnîşankirî bi wortmannin (TOCRIS Biosciences, Minneapolis, Minnesota) an aktîvatorê SC-79 (TOCRIS Biosciences, Minneapolis Adams, Minnesota) di nav hûrgelên destnîşankirî de hatin çandin.Navgîna ku madeyên kîmyewî tê de her roj dihat guhertin.
Di bin şert û mercên çanda normal de li ser kontrolkirina zindî û hucreyên KD-ê qeydên çarçowe-bi-çarçove hatin çêkirin, û wêneyên berevajî qonaxa 7 rojan her 10 hûrdem hatin berhev kirin.Wêneyên bi karanîna mîkroskopa berevajî ya Leica DM IRB ya bi komputerê ve hatî kontrol kirin ku bi qonaxek mekanîkî û armancek 10 × N-PLAN ve girêdayî ye bi kamerayek QImaging Retiga-SRV ve hatî girtin.Di dema wênegirtinê de, çandên hucreyê di 37 ° C de di atmosferek şil de bi 5% CO2 têne parastin.
Du xetên hucreya ES-ê yên xefika genê DTM096 û RRH048 ji Navenda Çavkaniyê ya Mişkê Mutant Herêmî (UC Davis, CA) hatin bikar anîn da ku xetên mişkê yên kêmasî yên Speccc11, bi navên Spec1lgtDTM096 û Spec1lgtRRH046 çêbikin.Bi kurtasî, hucreyên 129/REJ ES di blastocystên C57BL6 de hatine derzî kirin.Mişkên nêr ên chimerîk ên ku derketine, bi mêşên mê yên C57BL6 re hatin çandin da ku neviyên bi rengê kirasê agouti nas bikin.Hebûna vektorên xefika genê ji bo naskirina heterozîgotan hate bikar anîn.Mişk li ser paşxaneyek tevlihev a 129/REJ;C57BL6 hatin girtin.Cihê cîhê têketina vektora xefika genetîkî ji hêla RT-PCR, rêzgirtina genomê, û temamkirina genetîkî ve hate pejirandin (Wêneya Pêvek 1).Ji bo şopandina rêza CNCC ya mêşên Spec1lGT yên ducar heterozîgot, ROSAmTmG (#007576) û Wnt1-Cre (#003829) mêşên (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) hatin derbas kirin da ku ROSAmTmG û WntmTmG û Wnt1mt1-inccC allemutrelos hilberînin.Hemî ceribandinên li mişkan li gorî protokolên ku ji hêla Komîteya Lênihêrîn û Bikaranîna Heywanan a Sazîkî ya Navenda Bijîjkî ya Zanîngeha Kansas ve hatî pejirandin hatine kirin.
Embriyo di (1% formaldehyde, 0.2% glutaraldehyde, 2 mM MgCl2, 0.02% NP-40, 5 mM EGTA) ji bo 60 hûrdeman li germahiya odeyê hatin sabît kirin.Piştî sabîtkirina di çareseriya rengdêra X-gal de (5 mM potassium ferricyanide, 5 mM potassium ferrocyanide, 2 mM MgCl2, 0.01% sodium deoksycholate, 0.02% NP-40, 1 mg/ml X-gal) Pêşveçûna rengan di 37°C de hate kirin. .°C di nav 1-6 saetan de.Embriyo di 4% PFA-yê de paş-rast kirin û xuyang kirin.
Ji bo blota rojavayî, hucre di tampon lîza pasîf (Promega, Fitchburg, WI) de hatin lîz kirin ku bi tevliheviyek frensiyonên proteaza HALT (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO).Lîzat li ser 12% polyacrylamide Mini-PROTEAN TGX gêlên amadekirî (Bio-Rad, Hercules, CA) hatin hilanîn û veguheztin membranên Immobilon PVDF (EMD Millipore, Billerica, MA).Parzûn di 5% şîr de di PBS de ku 0.1% Tween tê de hatine asteng kirin.Antîkor di şevekê de li 4°C an jî saetekê li germahiya odeyê hatin înkubakirin.Reagenta Femto SuperSignal West ECL (Thermo Scientific, Waltham, MA) ji bo hilberîna nîşanê hate bikar anîn.Ji bo immunostaining, embrîyo di şevekê de di 4% PFA/PBS de hatin sabît kirin û cryopreserved.Cryosections tevnvîsê di PBS de ku %1 seruma bizinê ya normal (Thermo Scientific, Waltham, MA) û 0,1% Triton X-100 (Sigma-Aldrich, St. şev.bi antî-antîpod û antîpoşa duyemîn a fluorescentê (1:1000) 1 saetê li 4°C.Beşên rengkirî di navgîna zêr a ProLong (Thermo Scientific, Waltham MA) de hatin danîn û bi karanîna mîkroskopa konfokal a Leica TCS SPE dîmenên rût hatin wergirtin.Her immunostaining wekî sê ceribandinên serbixwe li ser cirossectionên herî kêm du embrîyoyên mutant hate kirin.Ezmûnek nûner tê nîşandan.
Hucre di tampon RIPA ya guhertî (20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1% NP-40, 130 mM NaCl, 10% glycerol, 2 mM EDTA, û înhîbîtorê proteazê HALT (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) hatin inkubasyon kirin. Bi kurtasî, lîzat bi berikên magnetîkî yên proteîna G (Life Technologies, Carlsbad, CA) ji berê ve hatin paqij kirin û dûv re bi şev di 4°C de hatin inkubasyon. Antîbody -β-catenin ku li jor hatî destnîşan kirin Ceribandinên co-IP-ê yên ku têne destnîşan kirin nûnerê çar ceribandinên serbixwe ne.
Hucreyên çandî yên sabît an tevnên embryonîk ên mişkî ji navenda mîkroskopa elektronîkî ya li Navenda Bijîjkî ya Zanîngeha Kansas re hatin peyda kirin.Bi kurtasî, nimûne di rezîliya EMbed 812 (Electron Microscopy Sciences, Fort Washington, PA) de hatin avêtin, di şevekê de li 60 °C polîmerîze kirin, û li 80 nm bi karanîna ultramicrotome Leica UC7 ku bi tîra almasê ve hatî veqetandin hate dabeş kirin.Beşan bi karanîna mîkroskopa elektronîkî ya veguheztinê JEOL JEM-1400 ku bi çekek Lab6 100 kV ve hatî vedîtin hatine dîtin.
Meriv çawa vê gotarê vedibêje: Wilson, NR et al.Kêmasiya SPECC1L dibe sedema zêdekirina aramiya hevbendên şikestî û kêmbûna delamînasyona şaneyên qertafên neuralî yên kranial.zanist.6, 17735;doi:10.1038/srep17735 (2016).
Saint-Jeanne, J.-P.Induction û cudahiya kêşeya neuralî.(Springer Science + Medya Karsaziyê; Landes Bioscience/Eurekah.com, 2006).
Cordero, DR et al.Di tevgerê de hucreyên girêbayên neuralî yên kranial: rola wan di pêşkeftina craniofacial de.Kovara Amerîkî ya Genetics Medical.Beş A 155A, 270–279, doi:10.1002/ajmg.a.33702 (2011).
Boland, RP Neurocristopathia: mezinbûn û pêşkeftina wê di 20 salan de.Pisporê zarokan.pathology.lêkolînxane.derman.17, 1–25 (1997).
Mangold E., Ludwig KU û Noten MM Pêşkeftina di genetîka qulên orofacial de.Trends in Molecular Medicine 17, 725-733, doi:10.1016/j.molmed.2011.07.007 (2011).
Minu, M. û Riley, FM Mekanîzmayên molekular ên koçkirina hucreya girêka neuralî ya cranial û şêwazê di dema pêşkeftina craniofacial de.Pêşveçûn 137, 2605-2621, doi: 10.1242 / dev.040048 (2010).
Dixon, MJ, Marazita, ML, Beaty, TH û Murray, JK Cleft lip and palate: famkirina bandorên genetîkî û hawîrdorê.şîroveya xwezayî.Genetics 12, 167-178, doi: 10.1038/nrg2933 (2011).
Ingram, CR et al.Di mêşên kêmasiya faktora-6 (Irf6)-rêkûpêkkirina înterferonê de morfogeneza anormal ya çerm, ling, û devera craniofacial.Genette Neteweyî.38, 1335–1340, doi: 10.1038/ng1903 (2006).
Peyrard-Janvid, M. et al.Mutasyonên serdest ên di GRHL3 de dibin sedema sendroma van der Waord û pêşveçûna peridermê devkî asteng dike.Am J Hum Genet 94, 23–32, doi: 10.1016/j.ajhg.2013.11.009 (2014).
Harris, MJ û Juriloff, DM Navnîşa mutantên mişkê yên ku di girtina lûleya nervê de kêmasiyên wan hene nûve bikin û ber bi têgihiştinek genetîkî ya bêkêmasî ya girtina lûleya nervê ve pêşve biçin.Lêkolîna kêmasiyên jidayikbûnê.Beş A, Teratolojiya Klînîkî û Molecular 88, 653-669, doi: 10.1002/bdra.20676 (2010).
Fantauzzo, KA & Soriano, P. Nîşana PDGFRalpha-ya navbeynkar a PI3K zindîbûn û belavbûna di pêşkeftina skeletal de bi rêgezek hundurîn a p53-girêdayî ve rê dide.Pêşveçûna Genê 28, 1005-1017, doi: 10.1101/gad.238709.114 (2014).
Kopp, AJ, Green, ND û Murdoch, JN Disheveled: Têkiliya berfirehbûna hevgirtî bi girtina lûleya neuralî re.Trendên di neurolojiyê de.26, 453–455, doi: 10.1016/S0166-2236(03)00212-1 (2003).