347 pêkhateya kîmyewî ya lûleya pêçandî ya pola zengarnegir, Nasnameya proteînên chaperone yên antîjen-A (HLA-A) yên leukocîta mirovî ya nû-bersiv a interferon-ê ku bi karanîna spektrometriya girseyî (CLMS) ve girêdayî ye.

Spas ji bo serdana Nature.com.Hûn guhertoyek gerokek bi piştgirîya CSS-ya sînorkirî bikar tînin.Ji bo ezmûna çêtirîn, em pêşniyar dikin ku hûn gerokek nûvekirî bikar bînin (an jî Moda Lihevhatinê ya di Internet Explorer de neçalak bikin).Wekî din, ji bo ku piştgirîya domdar misoger bike, em malperê bêyî şêwaz û JavaScript nîşan didin.
Sliders her slayd sê gotaran nîşan dide.Bişkojkên paş û paşê bikar bînin da ku di nav slaytan de bigerin, an jî bişkokên kontrolkerê slideyê yên li dawiyê bikar bînin da ku di her slaytê de bigerin.

Danasîna hilberê

Stainless Steel 347L Coil Tubes, Pola Pola: SS347L

Pergala îşaretkirina înterferonê bersivek sîtokînek xurt li hember cûrbecûr nîşanên patholojîk ên pathogenîk û hundurîn ên ji hawîrdorê çêdike, ku di encamê de binekomên proteînên înterferon-hilberî têne peyda kirin.Me spectrometrya girseyî ya bi navbeynkariya DSS-ê (CLMS) sepandin da ku têkiliyên nû yên proteîn-proteîn di qada proteînên ku ji hêla înterferon ve hatî çêkirin de tespît bikin.Digel proteînên pêvekirî yên înterferonê, me di heman demê de pêvekên nû yên nav-molekular û hundurîn-girêdayî yên proteînên înterferon-hilberî yên kanonîkî yên wekî MX1, USP18, OAS3, û STAT1 jî nas kirin.Me bala xwe da ser erêkirina ortogonal a komek nû ya torên proteînên înterferon-înducable ku ji hêla proteînên HLA-A (H2BFS-HLA-A-HMGA1) ve bi karanîna hev-immunoprecipitation û lêkolîna wan a din bi karanîna modela dînamîkên molekulî ve hatî çêkirin.Modelkirina dînamîkên konformasyonê yên kompleksa proteînê gelek malperên danûstendinê yên ku têkiliyên ku di vedîtinên CLMS de hatine nas kirin eşkere kirin.Bi hev re, em lêkolînek pîlot a CLMS-ê pêşkêş dikin da ku kompleksên nû yên nîşankirinê yên ku ji hêla interferon ve têne çêkirin nas bikin, û li benda karanîna berfireh a CLMS-ê ne da ku dînamîkên nû yên danûstendinên proteîn ên di mîkro hawîrdora tumor de nas bikin.
Berî ku bersivek berevanî ya adapteyî dest pê bike, pergala berevaniya xwerû ya mêvandar bersivek antîmîkrobial bi navbeynkariya malbatek cytokinesên alpha-helîkal ên veşartî yên bi navê interferon (IFNs) pêk tîne.Tîpa I IFN dersên IFNα û IFNβ bersivên hucreyî çalak dikin, di nav de dewletên antiviral, proapoptotic, proînflamatuar û antîproliferatîf.Di mirovan de, 13 binkûreyên IFNα têne zanîn, hemî li ser kromozoma 91 kom bûne. Ecêb e, tenê IFNα2 ji bo karanîna klînîkî hatî lêkolîn kirin.Di van demên dawî de, balek taybetî ji lêkolîna li ser celebên din ên IFNα re hate dayîn.Lêkolînek vê dawîyê destnîşan kir ku IFNα14 yek ji isoformên herî bi bandor e di sînordarkirina dubarekirina HBV2 û HIV-13,4 de li gorî binecureya IFNα2 ya kanonîkî.
Hat destnîşankirin ku kompleksên receptorên înterferonê yên celeb I (IFNAR1 û IFNAR2) aktîfkirin kaskadek veguheztina sînyalê bi navbeynkariya Janus kinases TYK2 û JAK15,6 vedigire.Van Janus kinase veguherînerên sînyalê û aktîvatorên proteîna transkrîpsiyonê (STAT1 û STAT2) li ser bermayiyên tîrosînê fosforîlate dikin da ku heterodimerîzasyona navbeynkariya SH2-ê bidin destpêkirin6.Dûv re, IRF9 heterodîmerên STAT girêdide da ku kompleksek trimerîkî ya gena faktora 3-ê ya IFN-stimulkirî (ISGF3) ava bike, ku vediguhezîne navokê û veguheztina zêdetirî 2000 genên înterferon-stimulkirî (ISG) 5,6,7,8 çêdike.
ISG bingeha pergala berevaniya xwezayê pêk tîne, nemaze di bersiva êrîşa virusê de.Wekî rêza yekem a parastinê li dijî enfeksiyona vîrusê, hucre bi lez û bez danûstendinên berfireh ên proteînên hucreyî bi cûrbecûr çalakiyên biyolojîkî re bicîh dikin.Van proteînan receptorên nasîna nimûne, molekulên îşaretkirinê, faktorên veguheztinê, û proteînên bi fonksiyonên rasterast ên antîvîrusê, û her weha rêgezên neyînî yên bersivên berevaniyê hene9.Piraniya agahdariya li ser çalakiya ISG-ê ji ekranên fonksiyonel ên ku ekranên zêdederbirînê bikar tînin10,11 an teknîkên bêdengkirina genê (siRNA, RNAi û CRISPR)12,13 têne ku tê de ISG-yên kesane têne diyar kirin an têne asteng kirin û çalakiya wan li ser vîrusên cihêreng têne ceribandin.Her çend van lêkolînan taybetmendiyên antiviral ên ISG-yên kesane destnîşan kirine, mekanîzmayên molekular ên bingehîn ên her ISG-ê bi gelemperî nenas dimînin.Bi gelemperî tête pejirandin ku gelek proteîn bi yek an çend cytokines re têkilî dikin da ku çalakiya tevahî misoger bikin, ji ber vê yekê an ISG rasterast têkilî dikin an jî têkiliyên wan ji hêla proteînên hucreyî ve têne rêve kirin.Mînakî, lêkolînek proteomîk a fotocrosslinked ya vê dawîyê ATPase VCP/p97 wekî hevkarek girîng a danûstendina IFITM3 nas kir, ku astengkirina wî dibe sedema kêmasiyên di dabeşkirina lîzozomî, zivirandin, û cotransporta IFITM3 bi pariyên vîrusê 14 .Bi karanîna immunoprecipitation, me VAPA, proteînek bi vezîkulê ve girêdayî ye, wekî hevalbendek danûstendinê ya bi IFITM1/2/3 re ku navbeynkariya mezinbûna vîrusê bi navbeynkariya kolesterolê dike, nas kir, û ev yek ji hêla lêkolînek din ve bi karanîna pergala du-hîbrîd a hevîrtirşkê ve hate pejirandin.Piştgiriya Zanistî 15, 16.
Pêvajoyek bingehîn a biyolojîkî ya ku di tepisandina enfeksiyonê û veguherîna nebaş de têkildar e, pêşandana antîgenê ye, ku ji hêla molekulên kompleksa histokompatîbilê ya mezin (MHC) ve tê navgîn kirin.Peptîdên (8-12 asîdên amînî dirêj) ji proteînên qutbûyî, ji zû ve hatî qedandin an xelet veqetandî di nav heterodîmera MHC-I (ji zincîrên giran û sivik ên MHC-I pêk tê, jê re β-2-mîkroglobulîn; β2M tê gotin) 17,18 têne barkirin.Trîmerên MHC-I yên stabîl ên ku di encamê de têne guheztin ber bi rûxara şaneyê ve, li wir peptîdên hundurîn ên hucreyê pêşkêşî şaneyên CD8+ T (hucreyên T yên sîtotoksîkî) dikin17.Hucreyên T van pathogen û şaneyên ku antîjenek taybetî ya tumor hildigirin nas dikin û tune dikin.Ji ber vê yekê, pathogen û hucreyên tumor bi gelemperî pêvajoya pêşandana antîgenê ditepisînin da ku ji çavdêriya berevaniyê dûr nekevin.Wekî din, MHC-I di 40-90% ji tumorên mirovî de têne rêve kirin û pir caran bi pêşgotinek xirabtir re têkildar e19.
Genên ku di bersivdana pathogenan de beşdar dibin divê zû di navbera rewşa bêhnvedanê û rewşa transkrîpsiyona çalak de veguherînin.Ji ber vê yekê, çend proteînên hucreyî têne hîpotez kirin ku di bersivdana daxwaziya bilind a IFN-ê de di demên kurt de, tevî nûvekirin û guheztina kromatîna promotor 20,21, beşdar dibin.Piraniya lêkolînan li ser nasnameya hevparên proteîna ISG-ê di hebûna IFN de sekinîn.Gelek lêkolînên proteomîk û transkrîptomî yên di pergalên hucreyên modelê de bandora IFN li ser perestgeha hucreyî ronî kirine.Lêbelê, tevî têgihiştinek mezin a dînamîkên ku ji hêla interferonan ve têne çêkirin, em hîn jî di derbarê tevlêbûna ISG-an de hindik dizanin.Dema ku tevlihevî û dînamîkên girêdayê demê yên nîşana înterferonê dihesibînin, du pirs derdikevin holê: (i) gelo gengaz e ku kompleksên pirproteîn ên ku di îşaretkirina bilez de têkildar in stabîl bikin û xefik bikin, û (ii) gelo ev têkilî dikarin li cîhê 3D werin nexşandin?
Ji bo çareserkirina van pirsgirêkan, me girêdana kîmyewî ya bi navbeynkariya disuccinimide suberate (DSS) digel spektrometriya girseyî (CLMS) pêk anî da ku tora pêwendiya proteîna IFNa-hilweşînkirî û dînamîkên wê lêkolîn bike.DSS di navbera bermahiyên proksîmal ên proteînan û/an kompleksên proteînan de di vivo de girêdanên kovalentî zêde dike.Analîza MS-ê ya paşîn deverên xaçgirêdana taybetî diyar dike ku nêzîkbûna cîhê deverên di hundurê proteînek taybetî de, ku jê re girêdanên hundurîn têne gotin, an jêr-yekîneyên di kompleksên proteîn de, ku jê re têkilhevî têne gotin, nîşan dide.Bi karanîna vê nêzîkbûnê, me gelek kompleksên proteîn-proteîn ên nû û hem jî torên pêwendiya pirproteîn ên ku ji hêla înterferon ve hatî çêkirin nas kirin.Bi ceribandina pêvekek ji van danûstendinên nû, em destnîşan dikin ku H2BFS (H2B-type H2B FS; ji vir şûnde wekî H2B tê binav kirin) û MDN1 ji bo HLA-A wekî hevkarên girêdanê tevdigerin.
Hucreyên Flo-1 yek ji wan modelên in vitro yên herî baş ên adenokarcinoma esophageal têne nas kirin ji ber ku ew taybetmendiyên sereke yên tumorên esophageal dişibînin22,23.Lêbelê, hemî tîmor ne immunogenîk in, û ji bo destnîşankirina ka hucreyên Flo-1 bersivê didin dermankirina înterferonê, me hucreyên Flo-1 bi 10 ng/ml IFNα 72 demjimêran derman kir.Hucreyên Flo-1 induksiyonek zû ya pSTAT1 û IRF1 nîşan dan, 2 demjimêran piştî dermankirinê dest pê dike û 72 demjimêran berdewam dike, bi kêmbûna bi demê re di astên rawestayî yên IRF1 de (Wêne 1A).ISG (MX1, IFITM1, OAS1/2, û ISG15) hate dîtin ku piştî 6 demjimêran bi tundî têne derxistin, bersivên qonaxa navîn û dereng a klasîk a IFNα (Wêne 1A) dişibînin.Bi hev re, van daneyan destnîşan dikin ku ev modela hucreyî dikare were bikar anîn da ku bersivên interferon lêkolîn bike.
Bersivên îfadeya proteîna cihêreng di hucreyên Flo-1 de piştî dermankirina IFNα.(A) Di hucreyên Flo-1 de ku bi 10 ng/ml IFNa ji bo 2, 6, 24, 48 û 72 demjimêran hatine derman kirin, bi immunoblot ve bi karanîna antîbodên ISG yên destnîşankirî ve hatî analîz kirin.(B) Coomassie şîn gêlên SDS-PAGE rengkirî yên ekstraktên hucreyê yên tevahî piştî ku bi DSS-ê re ji bo dem û hûrgelên destnîşankirî ve girêdayî ye.(C) Immunoblot-a nûner bi antîpodê p53 (DO-1) ji heman nimûneyan ve hatî lêkolîn kirin da ku asta girêdana proteînê binirxîne.
Ji bo girtina perestgeha danûstendina proteîna li cîhê, me DSS, kargêrek xaç-girêdanê ya ku bi berfirehî tête bikar anîn, ji ber permebûna wê ya bilind û dema reaksiyonê ya nisbeten kurt bikar anî.Dema reaksiyonê ya kurttir dibe alîkar ku pêşî li avakirina komikên mezin ên proteînên xaçgirêdayî bigire, bi vî rengî aramiya xaçerê biparêze.Ji bo destnîşankirina giraniya DSS-ê ya herî baş û dûrketina zêde-serhevdanî, me pêşî şaneyên 5, 2,5, û 1 mM DSS, bi rêzê, 5, 10, 5, û 30 hûrdeman eşkere kir, û lysates ji hêla SDS-PAGE-rengkirî ya Coomassie ve analîz kirin. (daneyên nayên nîşandan) .Lîzên hucreyê di asta herî nizm û di demek herî kurt de pir bi hev ve girêdayî ne.Ji ber vê yekê, DSS di nav 5 hûrdeman de 1, 0.5, û 0.1 mM hate titra kirin (Wêne 1B).Xaça girêdana çêtirîn bi 0.5 mM DSS ji bo 5 hûrdeman hate dîtin, û ev şert ji bo hucreyên ku bi IFNα têne derman kirin hatin hilbijartin.Wekî din, Figure 1C blotek rojavayî nîşan dide ku bi karanîna antîpota p53 (DO-1) ve hatî çêkirin da ku asta girêdana proteînê binirxîne.
Xaneyên Flo-1 bi 10 ng/ml IFNα 24 saetan berî ku xaçerê lê zêde bikin hatin derman kirin.Dûv re hucreyên bi xaçê ve girêdayî bi proteolîzasyona du-gavekî hatin lîz kirin û proteîn ji hêla FASP ve hatin hilberandin (Wêne. 2)24,25.Peptîdên trîptîk ên xaç-girêdayî bi spektrometrîya girseyî hatin analîz kirin (Hêjîrê 2).Dûv re spektrên MS/MS bi rêzika proteînê re têne hev kirin û bi MaxQuant26,27 ve têne pîvandin.Peptîdên bi xaçê ve girêdayî bi karanîna bernameya SIM-XL-ê ji spektrên bidestxistî hatin nas kirin, û pêkhateyên ferdî bi karanîna lûleyên nermalava hesabkirinê ya çavkaniya vekirî xQuest28 û SIM-XL29 di nav torgilokek tevlihev de hatin berhev kirin (Wêne. 2).SIM-XL danûstendinên proteîn-proteîn, zincîreyên hundurîn û zincîreyên kesane di tevlihevên proteîn ên hêsan an tevlihev de nas dike û ji bo dîtina danûstendinên di strukturên proteînê de nivîsan peyda dike.Digel vê yekê, ew li gorî qalîteya spekulê ya MS/MS29, her referansê wekî xalek nasnameyê rêz dike.Gelek têkilî û kompleksên proteîn-proteîn ên pir pêbawer hatine nas kirin, û komek nû ya danûstendinan bi karanîna hev-immunoprecipitation û guhertinên konformasyonel ên kompleksan bi karanîna modela dînamîkên molekulî (MD) ve hatî lêkolîn kirin (Wêne. 2) 30, 31.
Pêşniyara şematîkî ya rêbaza CLMS.Hucreyên Flo-1 24 demjimêran bi 10 ng/ml IFNα hatin derman kirin û dûv re bi proteîna xaçerê ya li cîhê bi karanîna DSS-ê û dûv re lîza hucreyê û trîpsînîzasyon hate derman kirin.Nimûneyên xaç-girêdayî bi karanîna spektrometerek girseyî ya Orbitrap ve hatin analîz kirin û ji bo perçebûna pêşgirên peptîdê di dema LC-MS/MS de bêtir nimûne hatin ceribandin.Du peptîdên girêdayî ji spektrên hatine bidestxistin bi karanîna Makîneya Naskirina Spektrumê ya Bernameya Peptîdên Xaçgirêdayî (SIM-XL) hatin nas kirin, û hemî pêkhate bi karanîna lûleyên hesabkerî di nav toreyek tevlihev de hatin berhev kirin.Têkiliyên pêbaweriya kêm li ser bingeha pîvanên rêjeya erênî yên derewîn (FDR) fîlter bikin.Gelek danûstendinên nû yên proteîn-proteîn ên pêbawer ên pêbawer bi karanîna hev-immunoprecipitation bêtir hatin piştrast kirin, û guhertinên konformasyonê yên di kompleksan de bi karanîna modela dînamîkên molekulî (MD) hatin lêkolîn kirin.
Bi tevahî ~ 30,500 û ~ 28,500 peptîd bi karanîna MaxQuant di nimûneyên IFNα yên nestimulkirî û teşwîqkirî de, bi rêzê ve hatin tesbît kirin (Tabloya Pêvek S1, Hêjîrê. 3A).Dabeşkirina dirêjahiya peptîdê di her du rewşan de rêjeyek bilind a peptîdên mezintir nîşan da, ku hebûna peptîdên bi xaçê ve girêdayî ye (Hêjîra 3B,C) nîşan dide.Digel vê yekê, rêjeyek mezin a peptîdên mezintir di nav 40-55-an de di nimûneyên dermankirî yên IFNa de hebûn (Hêjîra 3C).Nexşeya proteînê li dijî tundiya log2 destnîşan kir ku proteînên înterferon-stimulkirî yên klasîk li gorî nimûneyên nehatî derman kirin, di nav de MX1, IFIT1/3, OAS2/3, DDX58, û HLA-F (Wêne 3D) herî zêde bûn.Analîza rêyên ji bo proteînên ku ji sê qatan zêdetir dewlemendkirî di bersiva dermankirina IFNα de bi karanîna databasa rêça Reactome destnîşan kir ku pêşandan û pêvajoyek antîgenê ya bi navbeynkariya MHC-I rêça herî serdest bû (Wêne 3E).Li gorî raporên berê, bersivên antiviral ên ku ji hêla OAS û ISG15 ve têne navber kirin û her weha IFNα / β û nîşana sîtokinê di nav rêyên çalak de bûn.Wekî din, girêdanên xaçê yên proteîna lîzîn- û serine-taybetî ji spektrên MS/MS-ê yên ku bi eslê xwe hatine bidestxistin bi karanîna SIM-XL hatine nas kirin.Lêkolînek vê dawîyê ragihand ku 104 ISG 20 vîrus ji 9 çînên vîrusê vedigirin bi meta-analîzên lêkolînên zêde-îfadekirina ISG-ê di 5 celebên hucreyê de9.Lêbelê, ji bo derbaskirina tixûbên jimartinê yên vekolandina danehevên mezin, me dest bi danesek piçûktir kir da ku têkiliyên muhtemel ên di navbera navnîşa genên IRDS de ku ji hêla Padaria et al. ve hatî ragihandin, vekolin, ku piraniya wan ISG ne.
Nasnameya proteînên xaç-girêdayî yên cihêreng di bersiva IFNα de (daneyên ku ji MaxQuant hatine wergirtin).(A) Diyagrama Venn ku hejmara peptîdên hevpar û taybetî yên ku di nimûneyên Flo-1-ê yên dermankirî û nehatine dermankirin de hatine nas kirin temsîl dike.Dabeşkirina dirêjahiya peptîdê ya nimûneyên xaçgirêdayî yên nehatî dermankirin (B) û IFNα dermankirî (C).(D) Nexşeya germê ku di navbera şaneyên Flo-1 yên nehatî dermankirin û bi IFNα14 de hatî derman kirin log2 (tundiya LFQ) temsîl dike.Panela çepê proteînên ku di hebûna IFNα de herî çalak aktîf bûne nîşan dide.(E) Histogram ku piştî dermankirina IFNα 20 riyên sereke yên dewlemendkirinê temsîl dike.Databasa rêça Reactome ji çar-caran zêdetir guhertinên di proteînên IFNa-bersivdar ên birêkûpêk de analîz kir.
Teşwîqkirina ISG bi navbeynkariya Interferon baş tê belge kirin, lê di asta molekulî de kêm tê fêm kirin ka van proteînan çawa di nav rêzek fonksiyonên biyolojîkî de diqede.Me di navbera ISG-yên naskirî de têkiliyên proteînê bi pêbaweriyek bilind lêkolîn kir.Balkêş e, me torgilokek di nav de proteînên MX1, USP18, ROBO1, OAS3, û STAT1 nas kir ku di bersiva dermankirina IFNα de kompleksek mezin pêk tîne (Wêne 4, Tablo S2) 32,33,34.Ya herî girîng, ev têkilî di hemî sêweyên ku bi IFNα re têne derman kirin de hatin dîtin û di nimûneyên nehatî derman kirin de nehatin dîtin, pêşniyar dike ku ew bi taybetî di bersiva dermankirina IFNα de hatine çêkirin.Tê zanîn ku STAT1 bi transkrîpsiyonê îfadeya van ISG-an bi rê ve dibe, lê têkiliya wê bi ISG-an re di asta proteînê de nehatiye lêkolîn kirin.Struktura krîstal a STAT1 destnîşan kir ku domana wê ya helîkî (CCD) di dema damezrandina dimeran de bi DNA an protomeran re têkildar nabe35.Van α-helîs avahiyek helîkek helîk ava dikin ku ji bo ku têkilî çêbibin qadeke rûberê bi piranî hîdrofîlîk peyda dike 35 .Di daneyên CLMS-a me de, me dît ku piraniya danûstendinên bi STAT1 re li qada SH2 ya berî CCD, qada girêdanê, an dûvika C-termînalê (bermayî 700-708) pêk tê (Wêne 4A).Lêkolînek berê ragihand ku USP18 bi CCD û qada girêdana DNA-yê (DBD) ya STAT2 ve girêdide û di bin-yekîneya receptora interferonê ya celebê IFNAR2 de tê veguheztin da ku navbeynkariya nîşana înterferona celebê I 24 bike.Daneyên me di heman demê de destnîşan kir ku qada katalîtîk USP18 bi STAT1 DBD (Wêne 4A,D) re têkildar e, destnîşan dike ku STAT1 û STAT2 dibe ku di kişandina USP18-ê de ji IFNAR2 re rolek bilîzin.
Tora proteîn-proteîna ISG-ê di şaneyên xaç-girêdayî yên ku bi IFNα têne derman kirin de têne nas kirin.(A) Pîvana danûstendinê ya 2D ku têkiliyên proteîn-proteîn (di bernameya SIM-XL de hatî çêkirin) nîşan dide, digel xêzên ku danûstendinên navmolekularî temsîl dikin (birrîna crosslink li 3.5 hatî danîn).Domênên nasnameyên cihêreng bi rengê xwe32 têne nîşankirin: domaina MX1, Dynamin_N (73–249), Dynamin_M (259–547), û GED (569–660).Domên OAS3: OAS1_C (160-344), OAS1_C (559-745), NTP_transf_2 (780-872), û OAS1_C (903-108).Domain ROBO1, Ig_3 (67–151), I-set (170–258), I-set (262–347), Ig_3 (350–432), Ig_3 (454–529), fn3 (562–646), fn3 (678-758) û fn3 (777-864).Zeviyên STAT1: STAT_int (2–120), STAT_alpha (143–309), STAT_bind (321–458), SH2 (573–657), û STAT1_TAZ2bind (715–739).(B) Dîmendera dorhêl a proteînên bi hev ve girêdayî (MX1, UBP18, OAS3, ROBO1, û STAT1) bi têkilî û danûstendinên bi rêzê ve bi şîn û sor hatine nîşankirin.Rêjeya girêdana xaçê li 3.5 hate danîn.Pîvana xalan malperên danûstendina STAT1 bi MX1 (C), USP18 (D), ROBO1 (E), û OAS3 (F), û her weha malperên danûstendina K an S di navbera her du peptîd de destnîşan dikin.Di jimarê de, bendava xala-girêdanê bi 3.0 ve hatî danîn.(G) Cûreyên danûstendinê yên di navbera domên STAT1 û OAS3 DI de ku li ser strukturên proteînên wan ên li PyMol (PyMOL pergala grafîkên molekuler, guhertoya 2.0 Schrödinger, LLC.);STAT1 (pdb id: 1bf533) û OAS3 (idb id: 4s3n34).) bername.
Du îzoformên USP18 di mirovan de hatine şirove kirin, proteînek bi dirêjahî ya ku bi giranî di navokê de ye, û îzoformek bê navokek N-termînalê, USP18-sf, ku di nav sîtoplazma û navokê de bi rengek wekhev tê belav kirin 36 .Wekî din, N-terminus hate pêşbînîkirin ku bêsazkirî be û hewcedariya çalakiya isopeptidase an girêdana ISG1537 nake.Piraniya danûstendinên ku di lêkolîna me de hatine nas kirin li N-termînalê proteînê ne, destnîşan dikin ku ev têkilî bi dirêjahiya USP18 (Wêne 4A, D) ve girêdayî ne û bi vî rengî di navokê de çêdibe.Wekî din, daneyên me jî destnîşan dikin ku N-terminus ji bo danûstendinên proteîn-proteîn-proteîn pispor e.Cihê girêdana IFNAR2 di navbera bermayiyên 312-368 de cih digire, û bi taybetî, yek ji proteînên di kompleksê de bi vê herêmê ve girê nade (Wêne. 4A) 37,38.Van daneyên ku bi hev re hatine girtin destnîşan dikin ku qada girêdana IFNAR2 bi taybetî ji hêla proteîna receptor ve tê bikar anîn.Wekî din, tenê OAS3 û ROBO1 hatin dîtin ku bi domên jorîn ên N-terminus û malpera girêdana IFNAR2 re têkildar in (Wêne 4A).
ROBO1 ji supermalbata immunoglobulin (Ig) ya molekulên sînyala transmembrane ye û ji pênc domên Ig û sê domên fibronectin (Fn) li herêma derveyî hucreyê pêk tê.Li dû van qadên derveyî şaneyê herêmek parzûn-nêzîk û helixek transmembranek yekane 39 têne peyda kirin. Herêmek hundurîn a nesazkirî li dawiya C-yê ye û motîfên rêzikên parastî yên ku navbeynkariya girêdana proteîna bandorker dikin39 dihewîne.Navçeya ku ji asîdên amînî ~ 1100 heta 1600 dirêj dibe bi piranî tevlihev e.Me dît ku MX1 bi ROBO1-ê re bi navgînên Ig, Fn, û hundurîn hucreyî re têkilî dike, dema ku piraniya danûstendinên bi STAT1-ê re di navbera CCD, qada girêdanê û C-dawiya ROBO1 de çêdibe (Hêjî. 4A,E).Ji hêla din ve, danûstendinên bi herêmên girêdana DI, DIII, û OAS3 li seranserê proteîna ROBO1 (Hêjî. 4A) hatin belav kirin.
Malbata proteînên oligoadenylate synthase (OAS) RNA-ya dubendî ya hundurîn (dsRNA) qebûl dike û girêdide, di bin guhartinên konformasyonê de ye û oligoadenylates-girêdayî 2',5' (2-5 As) sentez dike 40 .Hat dîtin ku di nav her sê OAS-an de, OAS3 ji bo dsRNA herî zêde têkiliyek nîşan dide û herî hindik 2-5 As hevrêz dike, ku dikare RNase L çalak bike û bi vî rengî vejandina vîrusê sînordar bike 41 .Malbata OAS ji qadên transferase yên nukleotîd ên mîna polymerase beta (pol-β) pêk tê.Lêkolîna berê destnîşan kir ku çalakiya katalîtîk a qada C-terminal (DIII) bi qada dsRNA-binding (DI) ve girêdayî ye, ku ji bo çalakkirina OAS342 hewce ye.Me dît ku domên DI û DII yên OAS3 bi CCD û herêmek piçûk a di navbera SH2 û STAT1 TAD de têkilî dikin (Wêne 4A,F).Zêdekirina malperên cihêreng ên xaçerê yên li ser strukturên proteînê têkiliyek di navbera pelika β û DBD STAT1 de û çentek vekirî an valahiyek vekirî ya ku ji bermayiyên 60-75 di qada DI ya OAS3 (Hêjî. 4G) de hatî çêkirin, eşkere kir.Arasteya proteînên di kompleksê de her weha destnîşan kir ku yek ji danûstendinên bi OAS3 re bi şiyana girêdana DNA ya qada wê ya DI (Hêjî. S1A) re destwerdanê nake.Wekî din, qada N-termînalê ya GTPase MX1 bi domên DI û DIII yên OAS3 re bi berfirehî tevdigere (Wêne. 4A).Di heman demê de me di her sê dubareyên dermankirî yên IFNa de têkiliyek di navbera OAS1 û MX1 de jî dît, ku yek domainek OAS1 (di heman demê de ji hêla katalîtîk ve jî çalak e) bi her sê domên MX1 re têkildar bû (Wêne S2A,B).
Proteînên MX beşek ji malbatek mezin a GTPase-yên mîna dyneîn in ku navokek GTPase-N-termînalê ya ku GTP-ê girêdide û hîdrolîz dike, domanek navîn ku navbeynkariya xwe-civînê dike, û zipperek leucîn-termînala C-yê ku wekî GTPase tevdigere dihewîne. ).domain bandorker domain25,43.MX1 bi yekeyên polîmerazên vîrus ve girêdide da ku transkrîpsiyona gena vîrus43 asteng bike.Ekranek du-hîbrîd a hevîrtirşkê ya ku berê hatî ragihandin destnîşan kir ku MX1-ya têkildar bi PIAS1-ê ve çalakkirina genê ya bi navbeynkariya STAT1-ê bi astengkirina çalakiya girêdana DNA-yê asteng dike û di heman demê de çalakiya lîgaza SUMO E344,45 jî heye.Li vir, em destnîşan dikin ku MX1 bi STAT1 ve girêdide (Wêne 4C,D), di heman demê de ev têkilî çawa bandorê li aktîvkirina genê ya bi navbeynkariya STAT1 dike di bersiva IFNα de hewceyê lêkolînek din e.Wekî din, me her weha dît ku MX1 bi IFIT3 û DDX60 re di her sê dubareyên dermankirî yên IFNa de têkilî danî (Hêjîra S2C).
DDX60 helîkaza sîtoplazmîk a IFN-ê ye ku berê hate ragihandin ku di hilweşandina RIG-I-serbixwe ya RNA46 ya virusê de rolek dileyize.Ew bi RIG-I re têkildar dibe û îşaretkirina xwe bi şêwazek taybetî-lîgandê çalak dike 46. DDX60 ji domanek helîkazê ya DEXD/H-Box û domanek helîkaza C-termînalê ku RNAya vîrus û DNA47 girêdide pêk tê.Piraniya danûstendinên wê bi MX1 û IFIT3 re di nav deverên dirêj ên N- û C-termînalê de bêyî domên an motîfên kanonîkî pêk tê (Wêne. S2E,F).Lêbelê, MX1 di heman demê de bi domaina helicase ya DEXD/H-Box (Hêjîra S2E) re têkildar e.Proteînên malbata IFIT xwedan kopiyên hevgirtî yên motîfek helix-zivir-helix-ê ya bi navê dubarekirina tetrapeptide (TPR) ne.IFIT3 hate dîtin ku modulatorek erênî ya nîşana RIG-I ye û ji ber vê yekê pêkhateyek kompleksa MAVS.Bi hev re, daneyên me destnîşan dikin ku IFIT3 û DDX60 di serî de li herêmê di navbera TPR 3-6 ya IFIT3 de têkilî daynin û dibe ku di îşaretkirina RIG-I/MAVS de rolek bilîzin (Wêne. S2F).
Ji ber ku vekolîna tevahiya proteome ji hêla hesabkirinê ve zexm e, me dûv re tevahiya databasa UniProt ya mirovî ji bo hebûna yek ji dubareyên dermankirî yên IFNa vekoland.Di vê replica de, me ji bo HLA-A gelek torên pêbawer ên pêbawer dîtin.Analîzkirina rêyên proteînê yên ku ji hêla MS/MS-ê ve têne nas kirin nîşan da ku hilberandin û pêşkêşkirina antîjenê ya li ser bingeha MHC-I rêça sereke ye ku ji hêla interferon ve hatî çêkirin (Wêne. 3D).Ji ber vê yekê, me bal kişand ser lêkolîna danûstendinên proteîn ên molekulên MHC-I bi pêbaweriyek bilind di hemî nimûneyên xaç-girêdayî de.HLA ji domên α1, α2 û α3 û zincîrên sivik pêk tê, û mîkroglobulîn β2 (β2m) proteînek chaperone ya domdar e49.Gava ku di retîkûlûma endoplazmî de kom dibe, HLA di nebûna lîgandên peptîd de ne aram e50.Xala girêdana peptîdê ji hêla domên α1 û α2 yên pir polîmorfîk û bêsazkirî ve di forma ne-peptîdî de û qada α351 ya bi nisbeten kêm polymorphîk tê çêkirin.Di hebûna IFNα de, me du kompleksên HLA-A tesbît kirin: yek bi HMGA1 û H2B re têkildar dibe (Wêne 5, Tablo S3) û ya din bi MDN1, LRCH4 û H2B re têkildar dibe (Wêne 6).
IFNα bi H2B (H2BFS) û HMGA1 re tora pêwendiya HLA-A çêdike.(A) Pîvana 2D (di nermalava SIM-XL-ê de hatî çêkirin) ku di kompleksa H2B-HLA-A-HMGA1 de cûrbecûr danûstendinan nîşan dide: pêwend (şîn), girêdan (sor) û girêdana yekane (reş)..Domên nasnameyên cihêreng bi reng têne kod kirin32: H2B (histone; 2-102) û MHC-I (MHC_1; 25-203, koma C1; 210-290 û MHC_I_C; 337-364).Rêjeya xaçê-girêdanê li 3,5 hate danîn.Pîvanên xalî malperên danûstendina HLA-A bi H2B (B) û HMGA1 (C), û hem jî malperên danûstendina K an S di navbera her du peptîdan de destnîşan dikin.Di jimarê de, bendava xala-girêdanê bi 3.0 ve hatî danîn.(D) Têkiliyên di navbera proteînan de ku di strukturên proteînên H2B, HLA-A, û HMGA1 de di bernameya PyMOL de têne xuyang kirin.Van avahiyan bi karanîna servera Phyre2 (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2) model kirin û strukturên şablonê ji bo proteînên H2B, HLA-A û HMGA1 bi rêzê 1kx552, 1kj349 û 2eze55 bûn.
IFNα bi H2B (H2BFS), MDN1 û LRCH4 re tora pêwendiya HLA-A çêdike.(A) Zencîreyên xaçerê yên navmolekular (sor) û navmolekular (şîn) li ser nexşeyek înteraktîf 2D (di nermalava SIM-XL de hatî hilberandin) bi MDN1 ve wekî dor tê pêşkêş kirin.Rêjeya girêdana xaçê li 3.5 hate danîn.Domên nasnameyên cihêreng bi reng têne kod kirin32: H2B (histone; 2-102), MHC-I (MHC_1; 25-203, koma C1; 210-290 û MHC_I_C; 337-364) û LRCH4 (LRR_8 (68-126), LRR_8 (137-194) û CH (535-641)).(B) Têkiliyên di navbera proteînan de ku di strukturên proteînên H2B, HLA-A, LRCH4, û MDN1 de di bernameya PyMOL de têne xuyang kirin.Van avahiyan bi karanîna servera Phyre2 (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2) bi strukturên şablon 1kx552, 1kj349, 6hlu62 û 6i2665 ji bo proteînên H2B, HLA-A, LRCH4 û MDN1 hatine model kirin, herwiha.Pîlanên xalî yên ku ji bo HLA-A bi H2B (C), LRCH4 (D), û MDN1 (E) re malperên pêwendiya K an S nîşan didin.Ji bo plansaziyan, bendava xala xaçerê ya 3.0 hate danîn.
Digel parastina yekrêziya genomê, hîstone H2B di rêziknameya veguheztinê de jî têkildar e.Proteîna H2B ji domanek hîstone ya navendî (HFD) pêk tê ku ji hêla sê α-helîsên ku ji hêla lûpkan ve têne veqetandin û dûvikek C-termînalê 41,52 pêk tê.Piraniya danûstendina bi H2B re di helika α1 de pêk tê, ku bi heterodîmera HFD re trimerîzasyonê peyda dike (Hêjî. 5A,B).Her çend lîzîn di girêdana ADNyê de beşdar in, hin lîzîn jî cîhên acetilasyon an metilasyonê yên alternatîf in.Mînakî, bermayiyên K43, K46, û K57 ji H2B di girêdana rasterast a DNA-yê de ne beşdar in, lê dibin hedefa guhertinên cihêreng ên piştî-transkrîpsiyonê53.Bi heman rengî, bermayiyên K44, K47, û K57 di H2B de dibe ku di hebûna IFNα de, di nav de têkiliyên bi proteînên din re, rolek alternatîf bilîzin (Hêjî. 5A, B).Wekî din, hîstona H2B ya ekstrakromozomî di cûrbecûr şaneyên cûrbecûr de berteka xweparastinê çalak dike, wekî senzorek sîtosolîk tevdigere da ku perçeyên ADN-ya dubendî (dsDNA) yên ku ji ajanên enfeksiyonê an şaneyên zirardî ne54 tespît bike.Di hebûna vîrusên DNA de, kêmbûna H2B hilberîna IFN-β û fosforîlasyona STAT154 asteng kir.Her weha tê zanîn ku H2B ji histonên din ên bingehîn zûtir di nav navokê de û ji navokê derdikeve54.Têkiliyên H2B bi MDN1 û LRCH4 re jî di nimûneyên bijartî yên nehatî de hatine dîtin.Me dît ku HLA-A bi H2B re di her sê nimûneyên dermankirî yên IFNa û di yek nimûneyek dubarekirî ya nehatî de têkilî danî.Van daneyan rola H2B di fonksiyonek fîzyolojîk a alternatîf a ku ji rêziknameya veguheztinê ve girêdayî ye nîşan dide.
HMGA1 (koma tevgeriya bilind AT-Hook 1), nukleoproteînek piçûk a ku di asîdên amînî yên ku nexweşiyê pêşve dike de dewlemend e, bi HLA-A re hate nas kirin.Ew xwedan dûvikek C-termînala asîdî û sê DBD-yên cihêreng ên ku jê re AT hook têne gotin heye ji ber ku ew di dsDNA55,56 de bi xêza piçûk a herêma dewlemend-AT-ê ve girêdidin.Ev girêdan dibe sedem ku DNA biqelişe an rast bibe, rê dide ku faktorên transkripsiyona kanonîkî bigihîjin rêza wê ya lihevkirinê.Tê bawer kirin ku dûvika C-termînalê di danûstendinên proteîn-proteîn û berhevkirina faktorên veguheztinê de têkildar e, ji ber ku mutantên jêbirina C-termînalê nekarin transkripsiyonê bidin destpêkirin57.Digel vê yekê, ev domîn çend malperên fosforîlasyonê yên parastî hene ku ji bo kînazan substrat têne zanîn 58.Me danûstandinên HLA-A û H2B bi HMGA1 re li derveyî qada C-termînalê dît, pêşniyar dike ku qada C-termînalê bi giranî ji bo girêdana faktora transkrîpsiyonê tê bikar anîn (Wêne. 5A, C).Proteînên HMGA bi hîstone H1 re ji bo girêdana bi DNA-ya adapter re pêşbaziyê dikin, bi vî rengî gihîştinê zêde dikin57.Bi heman rengî, wusa dixuye ku HMGA bi hîstone H2B re bi DNA-ya girêdanê re di pêşbaziyê de bi hîstone H1 re têkildar dibe.HMGB1 di şaneyên dendrîtîk de îfadeya HLA-A, -B, û -C vedike, dibe sedema aktîvkirina wan59, lê têkiliyek di navbera HMG û HLA de berê nehatiye ragihandin.Me dît ku HMGA1 bi domên α1 û α3 yên HLA-A re, bi piraniya danûstendinên li derveyî 3 DBD-ya wê re têkildar e (Wêne 5A,C).Di destê me de hat dîtin ku HLA-A di navokê de cihgirtî ye (daneyên ku nayên xuyang kirin), û ji ber ku H2B û HMGA1 jî di navokê de hene, ev têkilî îhtîmal e ku di navokê de çêbibe.Zeviyên taybetî yên ku di navbera H2B, HLA-A, û HMGA1 de têne pîvandin di Figure 5D de têne xuyang kirin.
Piraniya danûstendinên HLA-A bi proteînên din re di nav domên wê yên α1 û α2 û qada C-termînalê ya têkçûyî de çêdibin (Wêne. 6).Di yek ji van mînakan de, me dît ku HLA-A bi dûvika N-termînalê ya têkçûyî ya LRCH4 re têkilî dike (Wêne 6A,D).LRCH4 aktîvkirina TLR4 û induksiyona cytokine ya LPS birêkûpêk dike, bi vî rengî bersiva berevaniya xwerû modul dike60,61.Ew proteînek membranê ye ku bi neh dubareyên leucine-dewlemend (LRR) û motîfek homolojiya Calmodulin (CH) di ektodomîna wê de ye, li dûv jî domainek transmembrane (TMD) 60, 62.Domên CH hatine ragihandin ku navbeynkariya proteîn-proteîn dikin 60.Di navbera domên LRR û CH-ê de bi qasî 300 asîdên amînî bi rêkûpêk gihîştî lê tevlihev e.Li ser bingeha fonksiyona herêmên bêserûber wekî navbeynkarên torên proteîn-proteîn û veguheztina vezîkuler 63, me dît ku piraniya danûstendinên proteînan li herêmên tevlihev çêdibin.Têkiliyên bi MDN1 re li seranserê dirêjahiya proteînê, di nav de qadên LRR1, LRR6, CH, û herêmên bêserûber, di nav de, H2B bi giranî bi qada CH ve girêdayî bû (Hêjî. 6A, B).Nemaze, yek ji danûstendinan TMJ-ê nagire, ku taybetmendiya nêzîkatiya CLMS-ê pêşniyar dike (Wêne 6A, B).
MDN1 di heman demê de wekî beşek tora proteîna HLA-A jî hate nas kirin (Wêne 6A).Ew ji malbata proteînên AAA (ATPases bi çalakiyên cihêreng ve girêdayî ye) ye.Ev heman qada N-termînala AAA-yê ye ku di zengilek hexamerîk de birêxistin dike û faktora kombûnê ji binyekeya rîbozomê ya 60S 64 radike.dişibe dynein64,65,66.Wekî din, herêma dewlemend a Asp/Glu li dû qada MIDAS (malpera girêdayî îyona metal) tê.Ji ber mezinahiya MDN1 (nêzîkî 5600 asîdên amînî) û hevahengiya wê ya sînorkirî bi proteînên baş-lêkolînkirî re, hindik di derbarê struktur û fonksiyona wê de di mirovan de tê zanîn.Me HLA-A, H2B, û LRCH4 wekî şirîkên girêdana MDN1 nas kir û meyla wan wekî kompleksên proteîn ên li PyMol eşkere kir (Wêne. 6A,B).Van sê proteînan bi qada AAA, qada girêdanê ya mîna dynein, û dibe ku qada MIDAS MDN1 re têkilî daynin.Di raporek berê de, paqijkirina pêwendiya proteînên baitê MDN1 wekî proteînek ku bi hîstone H2B67 ve girêdayî ye nas kir.Wekî din, lêkolînek vê dawîyê di heman demê de têkiliyek di navbera MDN û HLA-B de di hucreyên HCT116 de bi karanîna spektrometriya girseyî ya paqijkirî ya têkildar ragihand, ku encamên me piştgirî dike68.Nasnameya vê kompleksê di nimûneyên dermankirî yên IFNa de rola MDN1 di nîşankirina interferonê de pêşniyar dike.
Ji ber ku genên HLA pir polîmorfîk in, me ji daneyên rêzgirtina RNA yên hucreyên Flo-1 (daneyên ku nayên xuyang kirin) nexşeya HLA-A, -B, û -C ya rêzkirinê derxist.Rêzên peptîdê yên ku bi xwendina rêzgirtinê re hevaheng in, cûdahiyên girîng di navbera HLA-A, -B, û -C de li herêmên ku peptîdên xaç-girêdayî di HLA-A de cih digirin eşkere kirin (Wêne S3).Wekî din, me girêdana proteîn-proteîn a molekulên HLA-B/C bi proteînên H2B/HMGA1/MDN1/LRCH4 ve nedît.Ev pêşniyar dike ku têkiliya proteîn a ku di navbera HLA-A, MDN1, LRCH1 û HMGA1 de tê dîtin HLA-A taybetî ye.Wekî din, analîza proteomîk a nimûneyên ne-sergirêdayî (Tablo S4) destnîşan kir ku HLA-A li gorî HLA-B an HLA-C xwedan rêzek bilindtir e.Peptîdên ku ji bo HLA-A hatine nas kirin hem di nimûneyên bi IFNa-dermankirî û hem jî di nimûneyên dermankirî de bi tundî bilind bûn.
Ji bo ku pê ewle bibin ku danûstendinên ku li vir hatine nas kirin ne ji ber girêdana ne-taybetî ya du proteînan di nêzîkahiya cîhê de ne, me bi pêkanîna ceribandinên hev-immunoprecipitation du faktorên nû yên têkilî HLA-A piştrast kir.Têkiliyên HLA-A bi MDN1 û H2B endojen re hem di hucreyên Flo-1-ê yên bi IFNa-dermankirî û hem jî yên nehatî derman kirin de hatin tesbît kirin (Wêne 7, Wêne S4).Me piştrast kir ku HLA-A ji hêla H2B ve di immunoprecipitates de hate girtin û ku ev têkilî ji ber dermankirina IFNα bû ji ber ku HLA-A di nimûneyên immunoprecipitate yên ji hucreyên nehatî derman kirin de tune bû (Wêne 7A).Lêbelê, daneyên me destnîşan dikin ku IFNα bi rengek cûda girêdana HLA-A bi H2B û MDN1 re rêve dike.IFNα têkiliya di navbera H2B û HLA-A de çêdike, lê têkiliya wê bi MDN1 re kêm dike.Me dît ku MDN1 di kontrolan de bi HLA-A re têkildar bû, û lêzêdekirina IFNα ev pêwendiya serbixwe ya MDN1 ji hêla IFNα ve kêm kir (Wêne 7B,C).Wekî din, immunoprecipitation HLA-A H2B di hucreyên A549 de girt (Hêjî. S4), destnîşan dike ku ev têkilî ji celebê hucreyê serbixwe ye.Bi hev re, ev encam piştgirî didin têkiliyên interferon-navber ên HLA-A bi H2B û MDN1.
HLA-A H2B û MDN1 hev-paqij dike.Nûnerên endojen H2B (A) û MDN1 (B) immunoblots ji hucreyên Flo-1 ên bi IFNα-dermankirî hatin immunoprecipitated û ji bo antîbodîyên destnîşankirî vekolîn kirin.IgG ya mişk û keroşkê wekî kontrolek neyînî hate bikar anîn.(C) Rêjeyên têkildar (vedan) antîjenên cihêreng ji hêla immunoblots ve têne xuyang kirin ku li dijî antîkorên destnîşankirî têne ceribandin, β-actin wekî kontrolek barkirinê hate bikar anîn.
Taybetmendiyên avahîsaziyê yên yek ji torên pêbawer ên pêbawer ên bi interferon, H2B-HLA-A-HMGA1, hatin lêkolîn kirin.Me modelkirina dînamîkên molekulî wekî nêzîkatiyek alternatîf bikar anî da ku dînamîkên konformasyonê yên proteînên ku di vê kompleksê de têkildar in fam bikin (Wêne 8).Encamên ji daneyên CLMS îhtîmala konformasyonên cûda yên proteînên H2B, HLA-A, û HMGA1 destnîşan dikin.Ji ber vê yekê, kompleksên potansiyel ên jêrîn di navgînek çareserker de hatine model kirin: H2B-HLA-A, HMGA1-HLA-A, û H2B-HLA-A-HMGA1.Ekranek pêvekêşana proteîn-proteîn a destpêkê ya ku bi karanîna pakêta MOE (Molecular Operating Environment; Chemical Computing Group Inc., Montreal, Quebec, Canada) vesazkirinên muhtemel ên ku di navbera van proteînan de cûda dibin pêşniyar kir (Hêjî. 8A).Dîtina kompleksa proteîna docking gelek têkilî û konformasyonên gengaz eşkere kir (Wêne 5A, 8).Bi vî rengî, yek pêkvejiyana mimkun di Figure 8A de (bi girêdanên xaçê yên nîşankirî) tê xuyang kirin û ew bi karanîna lûleya modela MD-yê bêtir hate nirxandin.Wekî din, girêdana H2B an HMGA1 bi HLA-A re hevrêziya bilind a H2B ji bo HLA-A ronî dike (Wêne. 8A).
Dînamîkên konformasyonê yên torên gengaz ên di navbera kompleksên H2B (H2BFS) -HLA-A, HMGA1-HLA-A, û H2B-HLA-A-HMGA1 de.(A) Panela çepê nexşeyek 2D ye (di nermalava SIM-XL de hatî çêkirin) ji girêdanên xaçerê yên intramolekular (sor) û navmolekularî (şîn) (berbira xaçerê ya 3.5 hatî danîn).Wekî din, bermahiyên girêdana xaçerê yên ku hatine destnîşankirin li ser strukturên proteînên H2B, HLA-A, û HMGA1 têne nîşankirin.Bihevhatinên têkildar ên van proteînan bi karanîna lûleya dockingê ya ku di pakêta MOE de hatî bicîh kirin hatine derxistin.Panela çepê ya jêrîn cûrbecûr konformasyonên mimkun ên kompleksên H2B-HLA-A û HMGA1-HLA-A bi girêdanên cûda yên girêdana proteîn-proteîn (GBVI / WSA dG; kcal / mol) nîşan dide.(B) Veguheztina standard (RMSD) ya pozîsyonên atomê (ji bilî atomên hîdrojenê) ji bo her avahiyek proteîn.(C) Têkiliyên pêwendiya hîdrojenê ya proteîn-proteîna navmolekularî ji kompleksên cûrbecûr ên simulated ku têkiliyên taybetî yên dirêjahiya ≥ 10 ns dihesibînin.Dûrahiya qutkirina donor-qebûlkerê h-bond li 3,5 Å hate danîn, û goşeya qutkirina donor-H-qebûl li ≥ 160 ° -180 ° hate danîn.(D) Bermahiyên nîşankirî ku bi hevkarên xwe yên têkildar re têkilîyên proteîn-proteîna HLA-A pêk tînin, ku ≥ 20 ns vedigire, ku ji kompleksên dumî HLA-A-H2B û HLA-A-HMGA1 têne derxistin.Avahiyên proteînê avahiyek navînî ya 100 ns MDS temsîl dikin.(E) Têkiliyên di navbera kompleksên HLA-A-H2B û HLA-A-HMGA1 de li gorî danûstendinên ku ji hêla simulasyona H2B-HLA ve li ser 100 ns li ser bingeha cîhê danûstendina K an S di navbera her du peptîd de têne şopandin.Kompleksên /HMGA1-HLA-A/H2B-HLA-A-HMGA1.Nirxa sînorê ji bo nirxandina girêdanên xaçê 3.0 hate danîn, û danûstendinên taybetî yên ji MDS-ê ≥ 10 ns hatine girtin.Strukturên proteînê bi karanîna pakêtên BIOVIA Discovery Studio (Dassault Systèmes, BIOVIA Corp., San Diego, CA, USA) û Hawirdora Xebatê ya Molecular (MOE; Chemical Computing Group Inc., Montreal, Quebec, Kanada) hatin xuyang kirin.
Stabiliya molekulên HLA-A bi demê re (veguheztina standard; RMSD an veguheztina standard; RMSF) destnîşan kir ku hebûna proteînên H2B an HMGA1 di kompleksan de HLA-A stabîl dike (Wêne 8B, Figure S5).Proteîna HMGA1 bi cîhê B2M ya HLA-A ve girêdide, aramiya asîdên amînî HLA-A di kompleksa HLA-A-HMGA1 an H2B-HLA-A-HMGA1 de çêdike (Wêne 8B, Figure S5).bi taybetî, bermayiyên HLA ~ 60-90 û ~ 180-210 di hebûna H2B de kêm maqûl hatin dîtin (WÊN 8B).H2B û HMGA1 di kompleksa H2B-HLA-A-HMGA1 de girêdana HLA-A çêtir nîşan dan li gorî girêdana HLA-A bi H2B an HMGA1 tenê re (Wêne 8C,D; Tablo S5).Bermayiyên ku di girêdana hîdrojenê de cih digirin (Daşgiriya bilind a modela MD ≥ 10 ns) bi cîhên danûstendina CLMS (bermayiyên K an S) di kompleksê de hevûdu dikin, ku pêşniyar dike ku têkiliyên ku ji hêla CLMS ve têne nas kirin pir pêbawer in.Pêbawerî (Hêjîrê. 8E).Di modela CLMS û MD de, bermayiyên HLA-A di navbera 190-210 û bi qasî 200-220 asîdên amînî de hatin dîtin ku bi rêzê ve H2B û HMGA1 girêdidin (WÊN 8E).
Têkiliyên proteîn-proteîn torên avahîsaziya dînamîkî pêk tînin ku di bersiva hin stimulan de ragihandina hundurîn-hucreyî navbeynkariyê dikin.Ji ber ku gelek nêzîkatiyên proteomîkê guheztinên di asta giştî ya domdar a proteînekê de vedigirin, dînamîkên danûstendina proteîn-proteîn hewce dike ku amûrên pêvek ji bo girtina navberên girêdanê bigire, û CLMS yek amûrek wusa ye.Pergala îşaretkirina înterferonê torgilokek sîtokîn e ku dihêle hucreyan bersivê bidin rêzek nîşanên patholojîk ên pathogenîk û hundurîn ên hawîrdorê, ku di encamê de înduksyonek binkeyên proteînên înterferon-înducable bi dawî dibe.Me CLMS sepandin da ku diyar bikin ka têkiliyên proteîn-proteîn ên nû dikarin di nav panelek proteînên înterferonê de bêne nas kirin.Analîzkirina xaçerê ya proteîna gerdûnî di modelek hucreya Flo-1-a bersivdar-înterferon de hate bikar anîn da ku kompleksên proteîn bigire.Derxistina peptîdên trîptîk ji şaneyên ne-girêdayî û bi xaçê ve girêdayî rê dide jimartina peptîd, dewlemendkirina rê, û belavkirina dirêjahiya peptîd bi tundiya LFQ-ya diyarkirî.Proteînên înterferonê yên kanonîkî wekî kontrolek navxweyî ya erênî hatin nas kirin, di heman demê de pêvekên nû yên nav-molekular û hundurmolekular ên xaçê-girêdayî yên proteînên înterferon-hilberî yên kanonîkî yên wekî MX1, UP18, OAS3 û STAT1 hatin dîtin.Taybetmendiyên strukturel û danûstendinên cihêreng ên di warên fonksiyonel de hatine lêkolîn kirin.
Têkiliyek di navbera HLA-A, MDN1 û H2B de ji hêla immunoblottingê ve di hucreyên Flo-1 û A549 ên ku bi IFNα re hatine dermankirin û nehatine derman kirin hate tespît kirin.Encamên me ronî dikin ku HLA-A bi H2B re bi rengek girêdayî IFNα tevlihev dike.Xebata me rêgezek balkêş ji bo vekolîna bêtir li ser hev-herêmîkirina van her du kompleksan nîşan dide.Di heman demê de dê balkêş be ku meriv nêzîkatiya CLMS-ê li panelek xetên hucreyê berfireh bike da ku têkiliyên proteîn ên navbeynkar-înterferon-serbixwe-cûreya hucreyê nas bike.Di dawiyê de, me modela MD-ê wekî nêzîkatiyek alternatîf bikar anî da ku dînamîkên konformasyonê yên proteînên ku di kompleksa H2BFS-HLA-A-HMGA1 de têkildar in, fam bikin, ku axaftinên xaçerê yên intramolekular û navmolekularî dişopîne.Encamên ji daneyên CLMS îhtîmala konformasyonên cûda yên proteînên H2BFS, HLA-A, û HMGA1 destnîşan dikin.Veguheztinên cihêreng ên gengaz ên di navbera van kompleksên proteîna docking de gelek têkilîyên mîna yên ku di daneya CLMS de têne dîtin eşkere kirin.Yek ji hêza sereke ya rêbaza me ev e ku ew destûrê dide nasîna hêsan a genên pir polîmorfîk ên wekî HLA-yê bi hev re têkildar in, ji ber vê yekê dê balkêş be ku meriv têkiliyên proteînên taybetî-haplotîpa HLA-yê yên ku lêkolîna wan bi rengek din dijwar e lêkolîn bike.Bi hev re, daneyên me destnîşan dikin ku CLMS dikare were bikar anîn da ku têgihîştina me ya torên nîşana înterferon-hilweşînkirî berfireh bike û bingehek ji bo lêkolîna pergalên navhucreyî yên tevlihevtir ên di mîkro-hawirdora tumor de peyda bike.
Hucreyên Flo-1 ji ATCC hatin wergirtin û li DMEM (Gibco) ku bi 1% penîsîlîn/streptomycin (Invitrogen), 10% seruma fetal bovine (Gibco) ve hatî tije kirin û li 37°C û 5% CO2 tê hilanîn.Înkubasyon.Berî ku bi IFNα14 (ji hêla Kargeha Hilberîna Proteîna Edinburgh ve hatî çêkirin) şaneyên 70-80% lihevhatinê mezin bûn.Hemî kîmyewî û reagentên din ji Sigma Aldrich hatine kirîn heya ku wekî din neyê destnîşan kirin.
Hucreyên Flo-1 di lewheyên 6-kaniyê de hatin çandin û roja din hucre bi 10 ng/ml IFNα14 ji bo 24 demjimêran hatin derman kirin ku bi qasî% 80 lihevhatin.Şane sê caran bi PBS hatin şûştin û bi DSS (Thermo Fisher Scientific) ya nû amadekirî (di DMSO de hate helandin) di PBS de ji bo 5 hûrdeman li 37 ° C. bi giraniya paşîn a 0,5 mM ve hatin girêdan.Reaksiyona xaçerê ya DSS bi PBS-ê hate guheztin û DSS-ya mayî bi zêdekirina 20 mM Tris (pH 8.0) li PBS-ê ji bo 15 hûrdeman li 37 °C hate qut kirin.Şane bi şuştinê hatin komkirin û di lûleyên girêdanê yên kêm (Axygen) de hatin komkirin.
Pelê şaneyê bi 300 μl tampon lîza urea (8 M urea, 0,1 M Tris, pH 8,5) 30 hûrdeman li germahiya odeyê bi hejandina carinan re hate lîz kirin.Hemî gavên santrîfûjasyonê li 14,000 xg li 8 °C hatin kirin.Lîzatê 10 hûrdeman santrîfuj bikin û supernatant veguhezînin boriyek nû.Parçeyên zelal ên mayî di 150 μl ji tampona lîza duyemîn (2 M urea, 2% (w/v) SDS (sodyûm dodecyl sulfate)) 30 hûrdeman an jî bêtir têne hilweşandin heya ku çareseriyek avî ya homojen were bidestxistin.Lîzat 20 hûrdeman hate santrîfujkirin û lîzata ku di qonaxa berê de hatibû bidestxistin re hate tevlihev kirin.Li gorî rêwerzên hilberîner ên ji bo prosedurên mîkroplate bi karanîna pîvana Micro BCA (Thermo Fisher Scientific) tansiyonên proteînê hatin nirxandin.Nimûne zû di nîtrojena şil de hatin cemidandin û di -80°C de hatin hilanîn.
Nêzîkî 100 μg proteîna xaç-girêdayî ya çareserkirî bi karanîna protokola amadekirina nimûneya parzûnê ya guhêrbar (FASP) wekî ku ji hêla Wisniewski et al ve hatî destnîşan kirin hate hilberandin.69 Bi kurtasî, proteîn bi 200 µl tampon urea (8 M urea di 0,1 M Tris, pH 8,5) ve tê girêdan, tê dorvekirin û nîvco.Hemî gavên santrîfujasyonê li 14,000 xg li 25°C hatin kirin.Nîvê yekem a lîzata proteîna xaç-girêdayî hate veguheztin bo amûrek parzûna navendî ya 10 kDa Microcon ku bi membranek Ultracel-10 (Merck) ve hatî çêkirin, li dûv 25 hûrdeman li ser parzûnê santrîfuj kirin.Dûv re nîvê duyemîn ê proteînê têxin parzûnê û heman gavan dubare bikin.Vejandina proteînê bi zêdekirina 100 μl 17 mM tris (2-karboksîetîl) hîdrochloride fosfîn (TCEP) li tampon urea hate kirin.Recovery li ser termomikserek di 600 rpm de 30 hûrdem di 37 ° C de hate rijandin.Wekî din, stûn hate santrîfuj kirin û proteîna kêmkirî ya bi xaçê ve girêdayî bi karanîna 100 μl 50 mM iodoacetamide di tamponê urea de hate alkil kirin.Reaksiyona alkilasyonê di tariyê de 20 hûrdeman li germahiya odeyê hate kirin.Stûnê bizivirînin, dîwarên stûnê 3 caran bi 100 μl tampon urea bişon û dûv re santrîfuj bikin.Heman operasyon 3 caran bi 100 μl 100 mM amonyum bîkarbonat bi kar anîn.Berî trypsinîzasyonê, lûleya berhevkirinê bi yekî nû biguhezînin.Tamponê dehandinê ya ku tê de 50 mM amonyum bîkarbonat û 1 µl trîpsîn ku di tampona trîpsînê (Promega) de hatiye rijandin, têde bikin.Rêjeya trîpsînê bi proteînê re li ser 1:33 hate domandin, û reaksiyonên digestionê di şevekê de li 37 ° C. di jûreyek şil de hatin vegirtin.Peptîda bi xaçê ve girêdayî ji parzûnê 25 hûrdeman bi santrîfugê hate derxistin.Vejandina peptîdê bi zêdekirina 50 μl 0,5 M NaCl li parzûnê baştir bû, li dûv 25 hûrdeman santrîfug kirin.
Stûnên C18 Micro Spin (Aparata Harvard) ji bo şorkirina peptîdên trîptîk ên bi xaçê-girêdayî li pey protokola ku ji hêla Bouchal et al.70 ve hatî diyar kirin bi guheztinên piçûk hatine bikar anîn.Bi kurtasî, stûnên spin C18 bi sê şuştinên 0.1% asîda formîk (FA) li acetonitrile (AcN) (Merck) û du şuştinên 0.1% FA hatin çalak kirin.Stûn 15 hûrdem bi 0,1% FA ve hate hîd kirin.Nimûneyan li stûnên spin bar bikin û 3 caran bi 0,1% FA bişon.Peptîdên şorkirî bi dû hev re bi pileyek gav bi gav bi karanîna 50%, 80% û 100% AcN di 0,1% FA de hatin şuştin.Nimûne di koncentratorek SpeedVac Plus (Eppendorf) de hatin hişk kirin heya ku şilava bermayî bi tevahî winda bibe.Peptîdên hilanîn di 100 μl ji 0,08% trifluoroacetic acid di 2,5% AcN de hatin hilweşandin û pîvaz li ser NanoDrop 2000 (Thermo Scientific) hatin pîvandin.Nêzîkî 1 μg peptîdê xaçgirêdayî serê nimûneyê di pergala LC-MS/MS de hate derzî kirin.
Peptîdên xaç-girêdayî li ser pergalek UltiMate 3000 RSLCnano LC (Thermo Scientific) ku bi spektrometerek girseyî ya Orbitrap Exploris 480 (Thermo Scientific) ve hatî veqetandin.Peptîdên bi xaç-girêdayî li ser 300 μm ID, stûna girtina C18-pêş-stûna 5 mm dirêj a bi sorbent C18 PepMap100 û sorbent PepMap 5 μm (Thermo Scientific) hatin berhev kirin.Herikîna pompê ya bi 5 µl/min 0,08% trifluoroacetic acid ku di 2,5% AcN de hatî hilweşandin bar bikin.Peptîdên xaç-girêdayî li ser stûnek silica ya tevhevkirî ya analîtîk a bi dirêjahiya hundurê 75 μm û dirêjahiya 150 mm, ku bi sorbentek PepMap 2 μm (Thermo Scientific) dagirtî hatin veqetandin.Qonaxên mobîl A û B bi rêzê ji %0.1 FA di avê de û %0.1 FA di acetonitrile de pêk tê.Pîvaz ji %2,5 B dest pê dike û di nav 90 hûrdeman de bi xêzikî 40% B zêde dibe, dûv re di 2 hûrdemên din de heya %90 B zêde dibe.Pêkhatina qonaxa mobîl 10 hûrdem li 90% B hate domandin û dûv re di nav 2 hûrdeman de bi rêkûpêk daket 2.5% B.Stûna 8 hûrdem berî çerxa din li %2,5 B hate hevseng kirin.Peptîdên bi xaç-girêdayî yên ku ji stûna analîtîk hatine derxistin, di çavkaniyek ionîzasyona nanoelectrospray (NSI) de îyonîze bûne û di spektrometerek girseyî ya Exploris 480 (Thermo Scientific) de hatine derzî kirin.
Spektrometra girseyî ya Orbitrap Exploris 480 di moda pêwendiya daneya erênî de xebitî.Paqijkirinek tam di moda beşê de bi çareseriya 120,000 bi mîhengên rêzê ji m/z 350 Th heta m/z 2000 Th hate kirin.Hedefa AGC-ya normalîzekirî li% 300 bi dema têketina herî zêde ya 50ms hate danîn.Ji bo peptîdan tespîtkirina lûtkeya monoîzotopîk hatiye damezrandin.Parametreya rihetkirina astengkirinê wekî rast tête danîn heke pir hindik pêşgotin werin dîtin.Hêza herî kêm a yonîkî ya pêşbirkê li ser 5.0e3 hate danîn û rewşên barkirinê yên pêşîn heya +8-ê di ceribandinan de cih girtin.
Demjimêra di navbera şaneyên sereke de di moda pêwendiya daneyê de 2,5 çirke hate danîn.Dûrxistina girseyî ya dînamîkî piştî perçebûna yekem a îona pêşîn 20 s hate danîn.Pencereya îzolekirinê ya pêşîn li 2 Th.Cûreya enerjiya pevçûnê ya normalkirî ya bi moda enerjiya pevçûnê ya sabît di şanek MS/MS-ê ya girêdayî daneyê de hate hilbijartin.Enerjiya pevçûnê ji% 30 hate danîn.Çareserkirina Orbitrap li 15,000 û armanca AGC 100% hate danîn.Dema herî zêde ya derzîlêdanê ya xwerû 60 milîsaniyeyan e.
Berî şopandina tora proteîn-proteîn di nimûneyên bi xaçê ve girêdayî de, me pelên xav bi karanîna pakêta MaxQuant (guhertoya 1.6.12.0)26,27 vekir da ku peptîdên/proteînên peydakirî yên di nimûneyan de nas bikin.Wekî din, analîzên proteomîkî yên bi heman rengî li ser nimûneyên Flo-1-ê yên bêserûber ên ku bi IFNα ve hatine dermankirin û nehatine derman kirin hatine kirin.Daneyên MS/MS-ê di databasa mirovî ya UniProt (www.uniprot.org) de (12-ê Tebaxa 2020-an hatî barkirin, 75,093 navnîşan vedihewîne) bi karanîna motora lêgerînê ya çêkirî Andromeda27 ve hatî lêgerîn kirin.Lêgerîn bêyî destnîşankirina taybetmendiya enzîmê û guhertinên cihêreng ên deamîdasyon (N, Q) û oksîdasyon (M) hate kirin.Toleransên girseyî yên pêşîn li 20 ppm û îyonên hilberê li 0,02 Da hatine danîn.Veguheztina girseyî ya destpêkê û herî zêde li 10 ppm hate danîn.Girseya herî zêde ya peptîdê li 4600 Da hate danîn û wekheviya rêzê di navbera 7 û 25 asîdên amînî (aa) de hate danîn.Analîzên îstatîstîkî yên din bi karanîna bernameya Perseus (guhertoya 1.6.10.45) hate kirin.Naveroka proteînê bi normalîzekirina şiyana spektral a proteînê (hêzbûna LFQ; hêjmarkirina bê nîşankirî)27 hate hesibandin û nirxên tundiyê veguherî Log2.Kombûnek hiyerarşîk a proteînan ku bi hêza peptîdê wan ve hatî nas kirin bi karanîna pakêta pheatmap (v1.0.12) di R (v 4.1.2) de hate çêkirin.Analîzkirina dewlemendkirina rêyê bi karanîna databasa rêça Reactome ji bo proteînên bi IFNa-dermankirî yên ku li gorî nimûneyên nehatî derman kirin ji çar caran zêdetir çalak bûne hate kirin.
Nasnameya lîzînê (K) an serine (S) xaçegirên kîmyewî yên taybetî yên kompleksên proteîn ên ku ji hêla LC-MS/MS ve têne şopandin bi karanîna makîneyek nasnameyê ya spektroskopî (SIM-XL) ji bo peptîdên xaç-girêdayî (SIM-XL)29 hate kirin.Pêşîn, danûstandinên gengaz ên di navbera genên nîşana berxwedana zirarê ya DNA (IRDS) de bi interferon-a-girêdayî (IFN) vekolîn kirin bi karanîna daneya proteîna IRDS ku di Padariya et al.28 de hatî vegotin.Kontrolkirina hemî şert û dubareyên tevahiya UniProt-a mirovî ji hêla hesabkirinê ve zexm e, ji ber vê yekê databasa UniProt-a mirovî (www.uniprot.org) (12 Tebax 2020-an hatî dakêşandin, 75,093 navnîşan dihewîne) li dijî dubareyên dermankirî yên IFNα.Yek ji fîlterên ji bo danûstendinên pêbaweriya bilind.Van danûstendinên girîng ên ku hatine bidestxistin di hemî dubare û mercan de hatine berfireh kirin û ceribandin.
Di SIM-XL de, DSS ji bo crosslinker (XL) hate bikar anîn û guheztina giraniya XL û guheztina giraniya guheztinê bi rêzê ve li 138.06 û 156.07 hate danîn.Malperên reaksiyona xaçerê yên jêrîn têne hesibandin: KK, KS û KN-TERM, bêyî îyonên ragihandinê.Hem pêşgir û hem jî perçe ppm li 20-ê hate danîn û sînorê Xrea li 0.15 hate danîn.Trypsin bi tevahî taybetî hate hesibandin, û rêbazek perçebûnê ya C-xefika enerjiya bilind (HCD) hate bicîh kirin.Ji bo kêmkirina DB-ya dînamîk sînorê kêmkirina DB-ya dînamîkî ya XCorr û hindiktirîn hejmara peptîdan bi rêzdarî 2.5 û 2 hate danîn.Parametreyên din ev in: îhtîmala monoîzotopê û qutbûna rasthatina lûtkeyê, herî kêm 4 bermayiyên AA ji her stûyê û herî zêde barkirina stûnê, û 3 maksîmeyên parçebûnên windabûyî.Nexşeyên 2D yên dirûnkirî yên encam di (SIM-XL) de hatin analîz kirin û ji bo avakirina nexşeyên 2D nûneriya grafîkî ya xQuest28 hate bikar anîn.Zencîreyên proteînê yên li ser strukturên proteîn di PyMol (PyMOL Pergala Grafikên Molekular, guhertoya 2.0 Schrödinger, LLC) de têne peyda kirin.
Strukturên modela proteînê bi karanîna servera Phyre2 (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2)11 bi karanîna prensîbên modelkirina homoolojiyê û pêkanîna "Rêbaza Markov a Veşartî" hatine afirandin.Phyre2 strukturên modelê li ser bingeha hevrêziya rêzikan bi strukturên proteîn ên naskirî re diafirîne.Ji bo proteînên H2BFS, HLA-A, HMGA1, LRCH4, û MDN1, strukturên şablonê 1kx552, 1kj349, 2eze55, 6hlu62, û 6i2665 hatine bikar anîn.Wekî din, avahiya AlphaFold71 MX1, UBP18 û ROBO1 jî hate hesibandin.Avahiya proteînê bi karanîna pakêta BIOVIA Discovery Studio Visualizer (Dassault Systèmes, BIOVIA, San Diego, CA, USA) û pakêta Jîngeha Xebatê ya Molecular (MOE; Chemical Computing Group Inc., Montreal, Quebec, Kanada) hate xuyang kirin.