347 12.7 * 1.24mm lûleyên pêçandî yên pola zengarnegir, Mekanîzmaya molekulê ya kondensasyona elektrostatîk a hevdem û berhevkirina α-synuclein û tau

Spas ji bo serdana Nature.com.Hûn guhertoyek gerokek bi piştgirîya CSS-ya sînorkirî bikar tînin.Ji bo ezmûna çêtirîn, em pêşniyar dikin ku hûn gerokek nûvekirî bikar bînin (an jî Moda Lihevhatinê ya di Internet Explorer de neçalak bikin).Wekî din, ji bo ku piştgirîya domdar misoger bike, em malperê bêyî şêwaz û JavaScript nîşan didin.
Sliders her slayd sê gotaran nîşan dide.Bişkojkên paş û paşê bikar bînin da ku di nav slaytan de bigerin, an jî bişkokên kontrolkerê slideyê yên li dawiyê bikar bînin da ku di her slaytê de bigerin.

347 Stainless Steel Pipe Specification

347 12,7 * 1,24mm polayê zengarnegir lûleyên pêçandî

Pîvana Derveyî: 6.00 mm OD heya 914.4 mm OD, Mezinahiyên heya 24" NB-ya Ex-stock, Mezinahiya OD Tîpên Steel Ex-stock hene

Rêzeya Stûrahiya Borî ya SS 347: 0,3 mm - 50 mm, SCH 5, SCH10, SCH 40, SCH 80, SCH 80S, SCH 160, SCH XXS, SCH XS
WT: SCH5S, SCH10S, SCH40S, SCH80S, SCH160S, hwd.

Type: SS 347 Seamless Pipes |SS 347 ERW Pipes |SS 347 Pipes Welded |SS 347 Pipes Fabricated |SS 347 CDW tubes, LSAW Pipes / Seam-welded / Redrawn

Form: SS 347 Bolûlên dor / lûle, SS 347 lûleyên çargoşe / lûle, SS 347 lûle / lûleyên çargoşeyî, SS 347 lûleyên pêçandî, SS 347 şeklê "U", SS 347 Kulîlkên kekê pan, SS 347 lûleyên hîdrolîk

Dirêjahî: Tesadûfî yekane, Tesadûfî ducar & Dawiya dirêjiya pêwîst: Dawiya sade, Dawiya binavkirî, xêzkirî

Parastina Dawî: Kapikên Plastîk |Dawiya Derveyî: 2B, No.4, No.1, No.8 Neynikê ji bo lûleyên pola zengarnegir, Li gorî Pêdiviyên xerîdar biqedînin

Rewşa radestkirinê: Pîlankirî û tirşkirî, polandî, ronîkirî, kişandina sar

Teftîşkirin, Raporên Testê: Sertîfîkayên Testa Mill, EN 10204 3.1, Raporên Kîmyewî, Raporên Mekanîkî, Raporên Testa PMI, Raporên Teftîşa Dîtbar, Raporên Teftîşê yên Partîya Sêyem, Raporên Kevirê Pejirkirî yên NABL, Raporên Testa Wêranker, Raporên Testa Ne-Xeraker

Pakkirin: Di qutiyên darîn, çenteyên plastîk, kelûpelên pola de, an li gorî daxwazên xerîdar têne pak kirin

Taybetî: Mezinahî û Taybetmendiyên ji bilî jorîn dikarin li ser daxwazê ​​bêne çêkirin

Rêzeya Mezinahiya boriyê SS 347: 1/2 inç NB, OD heya 24 înç

ASTM A312 347: Boriya austenîtîk a bêserûber û rasterast a ku ji bo germahiya bilind û karûbarê korozyonê ya gelemperî tê armanc kirin.Metala dagirtî di dema weldingê de destûr nayê dayîn.

ASTM A358 347: Boriya austenîtîk a fusionê ya elektrîkî ji bo karûbarê koroz û / an germahiya bilind.Bi gelemperî tenê boriyek heya 8 inch li gorî vê taybetmendiyê têne hilberandin.Zêdekirina metala dagirtî di dema weldingê de destûr e.

ASTM A790 347: Boriya ferrîtîk/austenîtîk (duplex) ya bêqel û rasterast a ku ji bo karûbarê korozyonê ya giştî hatî armanc kirin, bi taybetî li ser berxwedana li hember şikestina korozyona stresê.

ASTM A409 347: Li boriyeke dîwarê ronahiyê ya austenîtîk bi pîvazên ji 14" heta 30" bi dîwarên Sch5S û Sch 10S ji bo gemarî û/an bilind fuzyoneke elektrîkî ya rast an jî spiral-siral hatiye welded

ASTM A376 347: Ji bo sepanên germahiya bilind boriyeke austenîtîk a bêserûber.

ASTM A813 347: Boriya austenîtîk a yek-seam, yek-an-du-weledkirî ji bo germahiya bilind û serîlêdanên korozî yên gelemperî.

ASTM A814 347: Ji bo germahiya bilind û karûbarê korozyonê ya gelemperî boriyek austenîtîk a wellandî ya sar.

347H Pipes Stainless Steel Pêkhatina Kîmyewî

Stainless Steel 347H Pipe Taybetmendiyên Mekanîkî

Stainless Steel 347H Pipes Taybetmendiyên Fîzîkî

Ji bo lûleya 347H Stainless Steel Notên Wekhev

Kombûna amyloid alpha-synuclein (αS) nîşanek nexweşiya Parkinson û synucleinopathiyên din e.Di van demên dawî de, proteîna tau ya ku bi gelemperî bi nexweşiya Alzheimer re têkildar e, bi patholojiya αS-ê ve girêdayî ye û hate dîtin ku di nav tevlêbûnên dewlemend-aS de bi hev re cih digire, her çend mekanîzmaya molekulê ya berhevkirina her du proteînan ne diyar e.Em li vir radigihînin ku qonaxa αS bi kondensasyona tevlihev a elektrostatîk bi polîpeptîdên bi bargiraniya erênî yên wekî tau ve di kondensasyonên şil de vediqete.Bi girêdana αS ya ji bo polycations û rêjeya kêmbûna valence ya tora koagulasyonê ve girêdayî ye, girêk bi leza gelasyon an hevgirtinê li dûv re kombûna amyloidê hêdî derbas dibe.Bi berhevkirina komek teknîkên biyofizîkî yên pêşkeftî, me karî ku veqetandina qonaxa şil-avî αS/Tau destnîşan bikin û faktorên sereke yên ku dibin sedema pêkhatina berhevokên heterojen ên ku her du proteînan di kondensatek proteînek şil de vedihewîne nas bikin.
Ji bilî beşên membranê, veqetandina mekanî ya di hucreyan de jî dikare bi avakirina laşên zengîn ên bi proteîn-dewlemend, şikil-wek ku jê re kondensatên biomolekuler an dilop têne binav kirin, bi pêvajoyek ku wekî veqetandina qonaxa şil-avî (LLPS) tê zanîn, were bidestxistin.Ev dilop bi danûstendinên demkî yên pir-valent, bi gelemperî di navbera proteîn an proteînan û RNA de têne çêkirin, û hema hema di hemî pergalên zindî de fonksiyonên cihêreng dikin.Hejmarek mezin ji proteînên LLP-kapasîteyên rêzikên tevliheviya kêm nîşan didin ku di xwezayê de û di avakirina kondensatên biomolekulî de pir tevlihev in3,4,5.Gelek lêkolînên azmûnî xwezaya maqûl, pir caran bêserûber û piralî ya proteînên ku van kondensasyonên şilî çêdikin eşkere kirin, her çend hindik di derbarê diyarkerên molekulî yên taybetî yên ku mezinbûn û mezinbûna van kondensatan kontrol dikin ji bo ziravtirek hişktir tê zanîn. rewş..
Daneyên nû hîpoteza ku LLPS-ya proteîn-rêveber a aberrant û veguheztina dilopan li strukturên zexm dibe ku rêyên hucreyî yên têkildar bin ku rê li ber pêkhatina berhevokên jehrîn ên bêçare yên ku bi gelemperî nîşanên nexweşiyên dejenerasyonê ne, piştgirî dikin.Gelek proteînên LLPS-ê yên bi tevliheviya xwerû (IDP), bi gelemperî pir bargiran û maqûl in, demek dirêj bi pêvajoya berhevkirina amyloid re bi neurodejenerasyonê re têkildar in.Bi taybetî, kondensasyonên IDP yên biomolekulerî yên wekî FUS7 an TDP-438 an proteînên bi domên tevlihev ên mezin ên kêm ên wekî hnRNPA19 hatine destnîşan kirin ku bi pêvajoyek bi navê şilbûnê re di nav formên gel-like an tewra hişk de kal dibin.pêkhatî.ji bo veguheztina qonaxa zexm (LSPT) wekî fonksiyonek demê an bersivek hin guheztinên piştî-wergerandinê an mutasyonên girîng ên patholojîkî1,7.
IDP-ya din a ku bi LLPS re di vivo de têkildar e Tau ye, proteînek tevlihev a mîkrotubulê ye ku berhevkirina amyloidê wê di nexweşiya Alzheimer10 de têkildar e, lê di van demên dawî de di nexweşiya Parkinson de (PD) û proteînopatiyên navokî yên sinaptîk ên din 11, 12, 13 jî têkildar e.Hate destnîşan kirin ku Tau bi xweber ji çareserî/sîtoplazmayê ji ber danûstendinên elektrostatîk ên bijarte14 vediqete, ku di encamê de dilopên tau-dewlemendkirî yên ku wekî coacervatên elektrostatîk têne zanîn têne çêkirin.Di heman demê de hate dîtin ku ev celeb pêwendiya ne-taybet hêza ajotinê ye li pişt gelek kondensasyonên biomolekuler ên di xwezayê de15.Di bûyera proteînek tau de, kombûna elektrostatîk dikare bi kombûna sade pêk were, ku tê de deverên proteîn ên berevajî barkirî pêvajoya veqetandinê dest pê dike, an jî bi berhevkirina tevlihev bi navgîniya danûstendina bi polîmerên barkirî yên neyînî re wekî RNA.
Di van demên dawî de, α-synuclein (αS), amyloîd IDP-ya ku di PD û nexweşiyên din ên neurodejenerative de bi hev re wekî synucleinopathy17,18 têne zanîn, di modelên hucreyî û heywanan de hate destnîşan kirin19,20 ku di kondensasyonên proteînan de bi behremendiya şikilî-şûnê ye.Lêkolînên in vitro destnîşan kirin ku αS bi kombûna sade di nav danûstendinên bi giranî hîdrofobîk de LLPS derbas dibe, her çend ev pêvajo pêdivî bi tansiyonên proteîn ên bêhempa û demên inkubasyonê yên netîpîkî dirêj dike19,21.Ma kondensasyonên bi αS-ê yên ku di vivo de têne dîtin ji hêla vê an pêvajoyên din ên LLPS-ê ve têne çêkirin, pirsgirêkek sereke ya bêçareser dimîne.Bi heman rengî, her çend kombûna aS amîloidê di neuronan de di PD û synucleinopathiyên din de hatî dîtin jî, mekanîzmaya rastîn a ku αS bi berhevkirina amyloid a hundurîn-hucreyî re derbas dibe ne diyar dimîne, ji ber ku zêde îfadekirina vê proteînê xuya nake ku bi serê xwe vê pêvajoyê bide destpêkirin.Bi gelemperî zirara hucreyî ya zêde hewce dike, ku pêşniyar dike ku hin cîhên hucreyî an jîngehek mîkro hewce ne ku ji nûvekirina meclîsên aS amyloid aS hundurîn.Yek jîngehek hucreyî ku bi taybetî ji berhevbûnê re têkildar e dibe ku hundurê kondensasyonên proteîn be 23 .
Balkêş e, ku αS û tau di nav mirovên bi nexweşiya Parkinson û synucleinopathiyên din de 24,25 di nav tevlêbûna nexweşiyên karakterîstîkî de hev-herêmî hatine dîtin û ceribandinan têkiliyek patholojîkî ya hevrêzî ya di navbera her du proteînan de 26,27 ragihandine ku têkiliyek potansiyel a di navbera kombûna αS û aS de pêşniyar dike. tau di nexweşiyên neurodejenerative de.nexweşî.Hate dîtin ku αS û tau di in vitro û in vivo de bi hev re têkilî û pêşvebirina berhevkirina hevûdu didin 28,29 û berhevokên heterojen ên ji van her du proteînan pêk tên di mejiyên nexweşên bi synucleinopathies de hatine dîtin 30 .Lêbelê, hindik di derbarê bingeha molekularî ya danûstendina di navbera αS û tau û mekanîzmaya hevberdana wê de tê zanîn.Hat ragihandin ku αS bi tauyê re bi navgîniyek elektrostatîk a di navbera herêma C-termînalê ya pir neyînî barkirî ya αS û devera navendî ya dewlemend a proline ya tau, ku di heman demê de bi bermahiyên barkirî yên erênî jî dewlemendkirî ye, bi tau re têkildar e.
Di vê lêkolînê de, em destnîşan dikin ku αS bi rastî dikare di hebûna proteîna tau de bi riya kondensasyona tevlihev a elektrostatîk ve nav dilopan veqetîne, berevajî têkiliya wê bi polîpeptîdên din ên bi bargiraniya erênî yên wekî poly-L-lysine (pLK), û di vê pêvajoyê de.αS ji bo tora dilopê wekî molekulek îskeleyê tevdigere.Me di pêvajoya mazinbûna coacervatên αS elektrostatîk de cûdahiyên berbiçav nas kirin, ku bi cûdahiyên di valentî û hêza danûstendina proteînên ku di tora coacervate de têkildar in ve girêdayî ne.Balkêş e, me li hevberdana proteînên αS û tau amyloid di coacervatên şilav ên dirêj-dirêj de dît û hin faktorên sereke yên ku rê li ber hevgirtina van her du proteînan di hevkêşeyên weha de vedigirin nas kirin.Li vir em vê pêvajoyê bi hûrgulî rave dikin, ku mekanîzmayek molekularî ya mumkun e ku di binhevkirina du proteînan de di tevlêbûnên taybetî yên nexweşiyê de ye.
αS xwedan dûvikek C-termînal a pir anyonîk a li pH-ya bêalî ye (Hêl. 1a), û me hîpotez kir ku ew dikare bi LLPS-ê re bi navhevkirina kompleksên elektrostatîk ên bi molekulên polîpeptîdê yên bêserûber ên polikasyonîkî re derbas bibe.Me polî-L-lîzînek 100-mayî (pLK) wekî molekula modela destpêkê bikar anî ji ber ku xwezaya wê ya polîmerî ya bi erênî barkirî û bêserûber di pH 32 ya bêalî de. Pêşî, me piştrast kir ku pLK bi navgîniya spektroskopiya NMR-ya Çareseriyê re bi qada Ct ya αS re têkilî dike. (Wêne 1b) 13C/15N-labeled αS bi hebûna zêdebûna rêjeyên molar αS: pLK bikar tîne.Têkiliya pLK bi Ct-domîna αS-ê re xwe bi tevliheviyên veguheztina kîmyewî û kêmbûna giraniya pezê li vê devera proteînê diyar dike.Balkêş e, dema ku me αS bi pLK re bi giraniya αS ya bi qasî.5-25 μM li ber hebûna polîetîlen glycol (5-15% PEG-8) (tampon LLPS-ya tîpîk: 10 mM HEPES pH 7.4, 100 mM NaCl, 15% PEG-8) me tavilê derbasî qadeke berfireh a avakirina proteînê bû. .dilop bi bikaranîna mîkroskopî floransence (WF) û qada geş (BF) hatin dîtin (Hêjîrê. 1c).Dilopên 1-5 μm ên ku αS-ya konsantrekirî vedihewînin (1 μM aS, AF488-αS bi etîketa AlexaFluor488 lê zêde kirin), taybetmendiyên wan ên elektrostatîk dikarin ji berxwedana wan a ji %10 1,6-hexanediol (1,6-HD) û hesasiyeta wê ya ji bo zêdebûna giraniya NaCl (Hêjîra 1c).Xwezaya şilî ya hevkêşeyên kompleksa elektrostatîk aS/pLK ji hêla kapasîteya wan a ku di nav milîçirkeyan de li hev bicivîne tê xuyang kirin (Wêne. 1d).Bi karanîna turbidimetry, me damezrandina dilopan di van şert û mercan de hejmartî kir, xwezaya elektrostatîk a danûstendina sereke ya ku bi aramiya wê ve girêdayî ye piştrast kir (Hêjîrê. 1e), û bandora rêjeyên cûrbecûr yên polîmerê li ser pêvajoya LLPS-ê nirxand (Hêl. 1f).Her çend damezrandina dilopê li ser cûrbecûr rêjeyên polîmeran tê dîtin, dema ku pLK ji αS zêde be pêvajo pir xweş e.LLP di heman demê de bi karanîna dextran-70 (70 kDa) an jî bi karanîna cûrbecûr formatên nimûneyê, di nav de dilopên şemitokên camê, bîrên mîkroplate yên ji materyalên cihêreng, Eppendorf an kapîlarên quartz têne dîtin.
Nûneratiyek şematîkî ya herêmên cûda yên proteîn ên di guhertoyên WT-αS û ΔCt-αS de ku di vê lêkolînê de têne bikar anîn.Domana N-termînala amfîpatîk, herêma hîdrofobîk amîloid-çêker (NAC), û qada C-termînala bi barkirina neyînî, bi rêzê bi şîn, porteqalî û sor têne xuyang kirin.Nexşeya Net Charge Per Residual (NCPR) ya WT-αS tê xuyang kirin.b Analîzkirina NMR ya danûstendina αS/pLK di nebûna kulîlkên makromolekulî de.Her ku giraniya pLK zêde dibe (rêjeyên molarê αS:pLK yên 1:0.5, 1:1.5, û 1:10, bi rêzê bi kesk sivik, kesk û kesk tarî têne xuyang kirin).c aS/pLK (rêjeya molarê 1:10) li 25 μM (1 μM αS-ya nîşankirî bi AF488 an pLK-ya nîşankirî Atto647N ji bo wênekirina WF-ê) di tampon LLPS de (jor) an jî bi 500 mM NaCl (li jêr çepê) an jî piştî 10-ê bi hev veqetînin. % 1,6-hexanediol (1,6-HD; binê rastê).Bara pîvanê = 20 μm.d Wêneyên mîkroskopî yên nûnerê tevhevkirina dilopên BF yên αS/pLK (rêjeya molarê 1:10) bi giraniya 25 μM;tîrên yekbûna dilopên kesane (tîrên sor û zer) di nav dilopek nû (tîra porteqalî) di nav 200 ms de destnîşan dikin.Bara pîvanê = 20 μm.e Belavbûna ronahiyê (li 350 nm) kombûna αS/pLK di tampon LLPS de berî û piştî lêzêdekirina 500 mM NaCl an 10% 1,6-HD li 25 μM αS (N = 3 dubareyên nimûneyê, navgîn û veqetîna standard jî diyar kirin).f Wêneya BF (jor) û analîza belavbûna ronahiyê (li 350 nm, li jêr) kombûna αS/pLK li 25 μM αS bi zêdebûna rêjeya molarê αS: pLK (N = 3 dubareyên nimûneyê, navîn û veqetîna standard jî diyar kirin).Bara pîvanê = 10 μm.Barê pîvanê li ser yek wêneyê pîvana hemî wêneyan di yek panelê de destnîşan dike.Daneyên xav di forma pelên daneya xav de têne peyda kirin.
Li ser bingeha çavdêriyên me yên kondensasyona kompleksa elektrostatîk aS/pLK û çavdêriyên berê yên αS wekî molekulek xerîdar a kondensata tau/RNA bi riya danûstendina rasterast a bi tau31 re, me hîpotez kir ku αS û tau dikarin di nebûna RNA de bi çareserkerê re hevber bibin. tîrkirî.di nav kompleksên elektrostatîk de, û αS proteîna îskeleyê ya di hevgirêdanên αS/Tau de ye (li jimar 2e dabeşkirina barkirina tau binêre).Me dît ku gava 10 μM αS û 10 μM Tau441 (bi rêzê ve 1 μM AF488-αS û 1 μM Atto647N-Tau, bi rêzê ve) di tampon LLPS de bi hev re hatin tevlihev kirin, wan bi hêsanî komikên proteîn ên ku her du proteînan vedihewîne, wekî ku ji hêla mîkroskopa WF ve tê dîtin, ava kirin.(Hêjîra 2a).Kolokkirina du proteînan di dilopan de bi mîkroskopî ya konfokal (CF) hate pejirandin (Hêjmara Pêvek. 1a).Dema ku dextran-70 wekî kargêrek berhevkirinê hate bikar anîn tevgerek wusa hate dîtin (Hêjmara Pêvek. 1c).Bi karanîna PEG an jî dekstranê bi FITC-ê nîşankirî, me dît ku her du ajanên qelebalix bi rengek wekhev li ser nimûneyan hatine belav kirin, ne veqetandin û ne jî hevgirtinê nîşan didin (Hêjmara Pêvek. 1d).Berevajî vê, ew pêşniyar dike ku di vê pergalê de ew veqetandina qonaxê bi navgîniya bandorên girseya makromolekulî pêşve diçin, ji ber ku PEG wekî ku di pergalên din ên LLP-ê de tê dîtin33,34, kargêrek qelebalixek bijarte ya domdar e.Van dilopên proteîn-dewlemend ji NaCl (1 M) re hesas bûn, lê ne ji 1,6-HD (10% v/v), taybetmendiyên wan ên elektrostatîk piştrast dikin (Hêjmara Pêvek. 2a, b).Tevgera wan a şilavê bi çavdêriya bûyerên dilopên yekbûyî yên millisecondî bi karanîna mîkroskopiya BF ve hate pejirandin (Hêjîr. 2b).
Wêneyên mîkroskopî yên Confocal (CF) yên αS/Tau441 di tampon LLPS de (10 μM ji her proteînek, 0.5 μM ji αS-aS-ya AF488 û Tau441-ya bi Atto647N-ya nîşankirî) bi hev ve dibin.b Wêneyên berevajiyê navbeynkariya cudahiya cûda (DIC) yên bûyerên tevhevkirina dilopên αS/Tau441 (10 μM ji bo her proteînekê).c Diyagrama qonaxê li ser bingeha belavbûna ronahiyê (li 350 nm) Tau441 LLPS (0-15 μM) di nebûna (çep) an hebûna (rast) 50 μM αS.Rengên germ zêdetir belavbûnê nîşan dide.d Belavbûna ronahiyê ya nimûneyên αS/Tau441 LLPS bi zêdebûna giraniya αS (Tau441 li 5 μM, N = 2-3 dubarekirina nimûneyê wekî ku tê destnîşan kirin).e Nûneratiya şematîkî ya hin guhertoyên proteîna tau û deverên cihêreng ên proteîna ku di vê lêkolînê de hatine bikar anîn: qada N-termînalê bi barkirina neyînî (sor), herêma dewlemend-proline (şîn), qada girêdana mîkrotubule (MTBD, bi porteqalî ve ronî kirin), û spiral cotek amîloid-çêker.herêmên filament (PHF) ku di nav MTBD (gewr) de cih digirin.Nexşeya Net Charge Per Residue (NCPR) ya Tau441 tê xuyang kirin.f Bikaranîna 1 μM AF488-aS nîşankirî û ΔNt- nîşankirî Atto647N, bikaranîna 1 μM AF488-aS an ΔCt-αS bi hebûna ΔNt-Tau (jor, 10 μM ji proteînek) an K18 (jêr, 50 μM ji bo proteînek ) ) ) mîkrografên WF-ê di LLPS an tampon K18 de hatine berhev kirin.Barên pîvanê di yek wêneyê de pîvana hemî wêneyên di yek panelê de (20 μm ji bo panelên a, b û f) nîşan dide.Daneyên xav ji bo panelên c û d wekî pelên daneya xav têne peyda kirin.
Ji bo ceribandina rola αS di vê pêvajoya LLPS-ê de, me pêşî li bandora αS li ser aramiya dilopê bi nefelometrî vekolîn kir û bi karanîna zêdekirina giraniya NaCl (Hêjî. 2c).Di nimûneyên ku αS-ê de hêjahiya xwê bilindtir dibe, ew qas nirxên belavbûna ronahiyê (li 350 nm) bilindtir dibe, ku ev yek rola aramkirina αS-ê di vê pergala LLPS de destnîşan dike.Bandorek bi vî rengî dikare bi zêdekirina giraniya αS (û ji ber vê yekê rêjeya αS: Tau441) bi qasî nêzîkê were dîtin.Zêdebûna 10-qatî li gorî giraniya tau (5 μM) (Hêjî. 2d).Ji bo ku nîşan bidin ku αS proteînek îskeleyê ye di coacervateyan de, me biryar da ku em li ser tevgera mutantê Tau-yê têkçûyî ya LLPS-ê lêkolîn bikin, ku jê re herêmek N-termînala bi barkirina neyînî (bermayiyên 1-150, binêre Fig. 2e) bi navê ΔNt-Tau tune ye.Mîkroskopî û nefelometrîya WF piştrast kir ku ΔNt-Tau bixwe neçû LLPS (Wêne. 2f û Fig. 2d). Lê belê, dema ku αS li çareseriyên belavbûna vê guhertoya Tau ya qutkirî hate zêdekirin, pêvajoya LLPS bi tevahî bû. bi tîrêjiya dilopê ya nêzî tîrêjiya dilopê ya çareseriyên tam-mezin ên Tau û αS-ê di bin şert û mercên wekhev û giraniya proteîn de tê sererast kirin.Ev pêvajo di bin şert û mercên qelebalixiya makromolekulî ya kêm de jî dikare were dîtin (Hêjmara Pêvek. 2c).Rola herêma αS ya C-termînalê, lê ne tevahiya dirêjahiya wê, di pêvajoya LLPS-ê de bi astengkirina damezrandina dilopê bi karanîna guhertoyek αS ya qutkirî ya C-termînalê ku bermayiyên 104-140 (Hêjî. 1a) yên (ΔCt-) tune ye, hate destnîşan kirin. αS) proteîn (Hêjêra 2f û Pêveka Hêjmara 2d).Tevlihevkirina αS û ΔNt-Tau bi mîkroskopiya floransê ya konfokal ve hate pejirandin (Hêjmara Pêvek. 1b).
Ji bo ceribandina bêtir mekanîzmaya LLPS-ê di navbera Tau441 û αS de, guhertoyek Tau ya din hate bikar anîn, ango parçeya fîlamenta helîkî ya hevgirtî (PHF) di qada mîkrotubulê-girêdanê (MTBD) de, ku heke ew çar domên dubare yên taybetmendiyê dihewîne, bi gelemperî jî tê zanîn. wekî perçeya K18 (binihêre Fig. 2e).Di van demên dawî de hate ragihandin ku αS bi tercîhî bi proteînek tau ya ku di domînek dewlemend-proline de ye di rêzek ku li pêşiya qada mîkrotubul-girêdanê ye ve girêdide.Lêbelê, herêma PHF di heman demê de ji bermahiyên barkirî yên erênî jî dewlemend e (binihêre Figure 2e), nemaze lysine (15% bermayiyan), ku me teşwîq kir ku em biceribînin ka gelo ev herêm jî beşdarî kondensasyona kompleksa αS/Tau dibe.Me dît ku K18 bi tenê nikare LLPS-ê bi giranî heta 100 μM di bin şert û mercên hatine ceribandin (tampon LLPS bi 15% PEG an 20% dekstran) bişkîne (Wêne 2f).Lêbelê, dema ku me 50 μM αS li 50 μM K18 zêde kir, çêbûna bilez a dilopên proteîn ên ku K18 û αS tê de hene bi nefelometrî (Hêjmara Pêvek. 2d) û mîkroskopa WF (Hêjî. 2f) hate dîtin.Wekî ku tê hêvî kirin, ΔCt-αS nekaribû tevgera LLPS ya K18 vegerîne (Wêne. 2f).Em bala xwe didin ku kombûna αS/K18 hewce dike ku bi qasê proteînek piçekî bilindtir be da ku LLPS li gorî αS/ΔNt-Tau an αS/Tau441 çêbike, tiştên din wekhev in.Ev bi têkiliyek bihêztir a herêma αS C-termînalê bi qada Tau-dewlemend a proline re li gorî qada mîkrotubule-girêdanê, wekî ku berê hate diyar kirin 31 re hevaheng e.
Ji ber ku ΔNt-Tau nikare LLPS-ê di nebûna αS de pêk bîne, me ev guhertoya Tau wekî modelek ji bo karakterîzekirina αS/Tau LLPS hilbijart ku ji ber hêsaniya wê ya di pergalên LLPS-ê de bi Tau-ya tev-dirêj (îsotîp, Tau441 / Tau441).bi pêvajoyên kombûnê yên tevlihev (heterotîp, αS/Tau441).Me di pergalên αS/Tau û αS/ΔNt-Tau de asta berhevkirina αS (wekî beşek ji proteîna qonaxa kondenskirî, fαS,c) ji hêla santrîfujasyon û analîza SDS-PAGE qonaxa belavbûyî (binihêre 2e) berhev kir, nirxên pir dişibin hev dîtin. ji bo hemî proteînan di heman konseyê de.Bi taybetî, me fαS,c 84 ± 2% û 79 ± 7% ji bo αS/Tau û αS/ΔNt-Tau, bi rêzdarî, bi dest xist, û destnîşan kir ku têkiliya heterotîpî ya di navbera αS û tau de ji têkiliya di navbera molekulên tau de çêtir e.navber.
Têkiliya bi polycationên cihêreng û bandora pêvajoya kondensasyonê ya li ser kînetîka αS yekem car ji hêla vegerandina fluorescence ve piştî rêbaza fotobleaching (FRAP) ve hate lêkolîn kirin.Me coacervates αS/Tau441, αS/ΔNt-Tau û αS/pLK ceriband (100 μM αS bi 2 μM αS AF488-αS û 100 μM Tau441 an ΔNt-Tau an 1 mM pLK tê pêve kirin).Daneyên di nav 30 hûrdemên pêşîn de piştî tevlihevkirina pêkhateyên nimûneyê hatin wergirtin.Ji wêneyên nûnerê FRAP (Hêjî. 3a, kondensasyona αS/Tau441) û kelûpelên dema wan ên têkildar (Wêne. 3b, Hêjmara Pêvek. 3), tê dîtin ku kînetîka αS pir dişibihe yên koacervatên Tau441.û ΔNt-Tau, ku bi pLK re pir zûtir e.Rêjeyên belavkirinê yên hesapkirî yên ji bo αS di hundurê coacervate de li gorî FRAP (wek ku ji hêla Kang et al. 35 ve hatî destnîşan kirin) D = 0,013 ± 0,009 μm2 / s û D = 0,026 ± 0,008 μm2 / s ji bo αS / TauΔNt û ji bo αS / αS / pergala αS/.pLK, Tau, û D = 0,18 ± 0,04 µm2/s, bi rêzê (Hêjîrê. 3c).Lêbelê, hevbera belavbûnê αS di qonaxa belavbûyî de çend rêzik ji hemî qonaxên kondenskirî bilindtir e, wekî ku ji hêla Spektroskopiya Têkiliya Fluorescence (FCS, binêre Fig. (D = 8 ± 4 µm2/s).Ji ber vê yekê, kînetîka wergerandina αS di coacervatan de li gorî proteînên di qonaxa belavbûyî de ji ber bandorên berbiçav ên girseya molekulî bi girîngî kêm dibe, her çend hemî coacervat di nîv saeta yekem a damezrandina xwe de taybetmendiyên şikilî diparêzin, berevajî qonaxa tau.kinetics zûtir di pLK condensate.
a-c FRAP analîza dînamîkên αS (2% AF488-aS nîşankirî) di coacervatên elektrostatîk de.Wêneyên temsîlî yên testên αS/Tau441 FRAP bi sê caran di (a) de têne xuyang kirin, ku derdorên sor deverên bêreng nîşan didin.Barê pîvanê 5 μm ye.b Kûçikên FRAP-ê yên navîn û (c) rêjeyên belavkirinê yên hesapkirî (D) ji bo 5-6 (N) dilopên cihêreng ên ji sê ceribandinan bi karanîna 100 μM αS û hevsengiyên Tau441 (sor) an ΔNt-Tau (şîn) an pLK (kesk) bi deh caran ji giraniya LLPS.Veguheztina standard a kêşeya FRAP bi rengê şîn tê xuyang kirin.Ji bo berhevdanê, hevrêziya belavbûnê αS di qonaxa belavbûyî de sê caran bi karanîna spektroskopiya pêwendiya fluorescence (FCS) hate destnîşankirin (ji bo bêtir agahdarî li Figure 3 û rêbazan binêre).d Spektrên EPR-ê yên X-bandê yên domdar ên 100 μM TEMPOL-122-αS di tampon LLPS de bê polîkasyon (reş) an bi hebûna 100 μM Tau441 (sor) an ΔNt-Tau (şîn) an 1 mM pLK (kesk).Inset dîmenek mezinkirî ya xetên zeviyê yên bihêz nîşan dide ku li wir guherînên herî dramatîk çêdibin.Di nebûna LLPS-ê de (bê PEG) girêkên 50 μM TEMPOL-122-αS bi polikasyonên cihêreng ve girêdidin.Kêmbûna bandê III li gorî band II (IIII/III) ya spektruma EPR-ya normalîzekirî tê destnîşan kirin ku rêjeyên molar ên Tau441 (sor), ΔNt-Tau (şîn) û pLK (kesk) zêde dike.Xêzên rengîn bi daneyan re bi karanîna modelek girêdanê ya hişk bi n cîhên girêdanê yên yeksan û serbixwe li ser her kevçîyê guncan nîşan didin.Daneyên xav di forma pelên daneya xav de têne peyda kirin.
Wekî pêvek, me dînamîkên αS-ê di coacervatên cihêreng de bi karanîna nîşankirina spin-ya rêvekirî (SDSL) û rezonansa paramagnetîkî ya elektronîkî ya domdar (CW-EPR) vekolîn.Vê rêbazê îspat kiriye ku di raporkirina nermbûn û dînamîkên IDP de bi çareseriyek mayînde ya rastîn36,37,38 pir bikêr e.Ji bo vê mebestê, me bermahiyên cysteine ​​di mutantên yekane yên Cys de ava kir û 4-hîdroksî-2,2,6,6-tetramethylpiperidine-N-oxyl (TEMPOL) sonda spin bikar anî.Berhemên maleimide wan etîket dikin.Bi taybetî, me sondajên TEMPOL li pozîsyona 122 an 24 αS (TEMPOL-122-αS û TEMPOL-24-αS) xistin.Di doza yekem de, em herêma C-termînalê ya proteînê, ku di pêwendiya bi polycations re têkildar e, dikin hedef.Di şûna wê de, pozîsyona 24 dikare di derheqê dînamîkên giştî yên proteînên di kondensatê de agahdarî bide me.Di her du rewşan de, îşaretên EPR-ê yên ku ji bo proteînên qonaxa belavbûyî hatine wergirtin bi radîkalên nitroxide re di rewşa bilez a bilez de têkildar in.Piştî veqetandina qonaxê di hebûna tau an pLK de (100 μM TEMPOL-αS, Tau441 an ΔNt-Tau bi rêjeya 1:1 an pLK bi rêjeya 1:10), zêdebûnek di tîrêjiya lûtkeya têkildar de hate dîtin. spektra EPR ya αS.Xeta windabûnê fireh bû, nîşana kêmbûna kînetîka veguheztina αS ya di dilopan de li gorî proteîna di qonaxek zirav de (Hêjî. 3d, Hêjmara Pêvek. 4a).Ev guhertin li pozîsyona 122-an bêtir diyar in. Dema ku di pozîsyona 24-an de hebûna pLK bandorê li kînetîka sondayê nekir, li cîhê 122-ê şeklê xeta spektral bi girîngî guherî (Hêjmara Pêvek. 4a).Dema ku me hewl da ku em spektrên li pozîsyona 122 ya du pergalên αS/polycation model bikin ku modela îsotropîk (Hêveka Pêvek 5a) bikar tînin ku bi gelemperî ji bo danasîna dînamîkên IDP38,39-ya spin-labelkirî tê bikar anîn, me nekarî spektrên ceribandinê ji nû ve ava bikin..Simulasyona spektral ya pozîsyona 24 berevajiyên spinan (Hêjmara Pêvek. 5a).Ev destnîşan dike ku di cîhê mîhengên spinê yên herêma C-termînalê ya αS-ê de di hebûna polikasyonan de pozîsyonên bijartî hene.Dema ku perçeya αS-ê di qonaxa kondedkirî de di bin şert û mercên EPR-ya ezmûnî de (84 ± 2%, 79 ± 7%, û 47 ± 4% ji bo αS/Tau441, αS/ΔNt-Tau, û αS/pLK, bi rêzê ve tê hesibandin - Binêre Pêvek. Fig. 2e ya analîza daneyê c), tê dîtin ku berfirehbûna ku bi rêbaza EPR-ê hatî vedîtin bi giranî danûstendina herêma C-termînalê ya αS bi polîkasyonên cihêreng di qonaxa kondenskirî de nîşan dide (guherîna sereke dema ku TEMPOL-122- bikar tîne αS), û ne kondensasyona proteînê.Di sondajê de zêdebûna mîkrovîskozîteyê tê dîtin.Wekî ku tê hêvî kirin, dema ku 1 M NaCl li tevlêkirinê hat zêdekirin, di bin şert û mercên ji bilî LLPS-ê de spektruma EPR ya proteînê bi tevahî hate vegerandin (Hêjmara Pêvek. 4b).Bi tevayî, daneyên me destnîşan dikin ku guheztinên ku ji hêla CW-EPR ve hatine vedîtin bi giranî danûstendina herêma C-termînalê ya αS bi polîkasyonên cihêreng di qonaxa kondensasyonê de nîşan dide, û ev têkilî bi pLK re ji Tau re bihêztir xuya dike.
Ji bo ku em di derheqê proteînên di coacervate de bêtir agahdariya strukturel bistînin, me biryar da ku pergala LLPS-ê bi karanîna NMR-ê di çareseriyê de lêkolîn bikin.Lêbelê, me tenê dikaribû beşa αS ya ku di qonaxa belavbûyî de maye tespît bike, ku dibe ku ji ber kêmbûna dînamîkên proteînê di hundurê coacervate de û qonaxek drav li binê çareseriyê di analîza NMR de be.Dema ku me avahî û dînamîkên proteîna ku di qonaxa belavbûyî ya nimûneya LLPS de bi karanîna NMR-ê ve mayî vekolîn kir (Hêjîra Pêvek. 5c, d), me dît ku proteîn di hebûna pLK û ΔNt-Tau de hema hema bi heman rengî tevdigere. ku di strukturên duyemîn û dînamîkên pişta proteînê de bûn, ji hêla ceribandinên li ser veguheztina kîmyewî ya duyemîn û rihetbûna R1ρ ve hatin eşkere kirin.Daneyên NMR destnîşan dikin ku C-termînala αS di dema ku cewhera xwe ya bêserûber diparêze, mîna rêzika proteînê ya mayî, ji ber danûstendinên wê yên bi polycations re, windahiyek girîng a nermbûna konformasyonê digire.
Ji ber ku berfirehbûna sînyala CW-EPR ku di qonaxa kondenskirî ya TEMPOL-122-αS de tê dîtin, pêwendiya proteînê bi polikasyonan re nîşan dide, me titrasyonek EPR pêk anî da ku di nebûna LLPS-ê de girêdana girêdana αS bi polykasyonên cihêreng re binirxîne (tu kombûna Buffer LLPS), pêşniyar dike ku têkilî di qonaxên hûr û hûrkirî de yek in (ya ku ji hêla daneyên me ve hatî pejirandin, Fig. 4a û Pêvek. 6).Armanc ev bû ku em bibînin ka hemî coacervat, tevî taybetmendiyên wan ên hevpar ên mîna şilavê, di asta molekular de tevgerek cihêreng a bingehîn nîşan didin.Wekî ku tê çaverê kirin, spektruma EPR bi zêdebûna giraniya polikasyonê re berfireh bû, ku kêmbûna nermbûna molekulê ji ber danûstendinên molekulî yên hemî hevkarên danûstendinê hema hema heya têrbûnê nîşan dide (Wêne. 3e, Hêjmara Pêvek. 6).pLK li gorî ΔNt-Tau û Tau441-ê bi rêjeyek molek kêmtir (polîkasyon: αS) vê têrbûnê bi dest xist.Di rastiyê de, berhevdana daneyan bi modelek girêdanê ya nêzikî ya ku n cîhên girêdanê yên wekhev û serbixwe destnîşan dike destnîşan kir ku domdariya veqetandina xuya ya pLK (~ 5 μM) ji ya Tau441 an ΔNt-Tau (~ 50 μM) kêmtir e. ).μM).Her çend ev texmînek hişk e, ev pêşniyar dike ku αS ji bo polikasyonên hêsan ên bi herêmên barkirina erênî yên domdar re têkiliyek bilindtir e.Ji ber vê cûdahiya têkiliya di navbera αS û polîkasyonên cihêreng de, me hîpotez kir ku dibe ku taybetmendiyên wan ên şil bi demê re cûda biguhezin û bi vî rengî ji pêvajoyên LSPT yên cihêreng cefayê dikişînin.
Ji ber hawîrdora pir qelebalix a di hundurê proteîna coacervate û xwezaya amyloid a proteînê de, me tevgera coacervate bi demê re dît da ku pêvajoyên gengaz ên LSPT-ê tespît bikin.Bi karanîna mîkroskopiya BF û CF (Wêne 4), me dît ku αS/Tau441 bi rêjeyek mezin di nav çareseriyê de diqelişe, dilopên mezin çêdike ku bi rûyê binê bîrê re têkilî û şil dikin, wekî ku tê hêvî kirin, wekî dilopên tije diherikin (Hêjîra Pêvek 7d);em ji van strukturên binî re dibêjin "raftên proteîn".Van avahiyan herikîn mane ji ber ku wan şiyana hevgirtinê diparêzin (Hêjmara Pêvek. 7b) û piştî ku LLPS hate destpêkirin çend demjimêran dikarin werin dîtin (Wêne. 4 û Hêjmara Pêvek. 7c).Me dît ku pêvajoya şilkirinê li ser rûyê materyalên hîdrofîlî ne ji materyalên hîdrofobî (Pêvek Fig. 7a), wekî ku tê hêvîkirin ji bo coacervatên elektrostatîk ên bi barên nehevseng û ji ber vê yekê potansiyelên rûkala elektrostatîk ên bilind tê pêşwaz kirin.Nemaze, aS/ΔNt-Tau hevgirtin û rafting bi girîngî kêm bûn, dema ku kondensasyonên αS/pLK bi girîngî kêm bûn (Wêne. 4).Di dema înkubasyonê ya kurt de, dilopên αS/pLK karîbûn rûbera hîdrofîlîk li hev bikin û şil bikin, lê ev pêvajo zû rawestiya û piştî 5 demjimêran ji înkubasyonê, tenê bûyerên hevgirtinê yên bi sînor û şil nehat dîtin.- veguherîna gel-drip.
Nûnera BF (panelên gewr) û CF (panelên rastê, bi AF488-aS bi kesk etîketkirî) nimûneyên hevgirtî yên ku 100 μM αS (1% nîşana fluorescent) di tampona LLPS de bi hebûna 100 μM Tau441 (wêneyên floransê yên jorîn) ΔNt. -Tau (navend) an 1 mM pLK (jêr) di demên cuda yên înkubasyonê û bilindahiyên navendê de (z, dûrbûna ji binê pelê baş).Ceribandin 4-6 caran ji hev serbixwe bi heman encaman hatin dubarekirin.Kevirên αS/Tau441 piştî 24 saetan têne şil kirin û ji wêneyê mezintir raftan çêdikin.Bara pîvanê ji bo hemî wêneyan 20 μm ye.
Dûv re me pirsî gelo hewzên proteînên mîna şilî yên mezin ên ku di αS/Tau441 LLPS de hatine çêkirin dê bibe sedema kombûna amyloid a yek ji proteînên ku hatine lêkolîn kirin.Me bi zeman re bi mîkroskopa WF-ê di bin heman şert û mercên li jor de mezinbûna dilopên αS/Tau441 şopand, lê bi karanîna 1 μM AF488-aS û Tau441-ya bi etîketa Atto647N (Hêjî. 5a).Wekî ku tê hêvî kirin, me li seranserê pêvajoya mazinbûnê de cihgirtina bêkêmasî ya proteînê dît.Balkêş e, ji ca.Piştî 5 saetan, avahîyên ne-dorveger ên tundtir di hundurê raftan de, ku me jê re digotin "xal" hatin dîtin, hin ji wan bi αS-ê hatin komkirin, û hin jî di Tau441 de hatin dewlemend kirin (Wêne. 5a, tîrên spî).Van deqan her gav ji bo αS/ΔNt-Tau ji αS/ΔNt-Tau pirtir di nav raftan de hatine dîtin.Di nav dilopên pergalên pLK û Tau de ku ji bo fusion/şilbûnê bêkêmasî ne deqên cihê tunebûn.Ji bo ceribandinê ka gelo ev rengên ku di nav wan de αS û Tau441 hene berhevokên mîna amyloidê ne, me ceribandinek bi vî rengî bi karanîna mîkroskopa CF pêk anî ku tê de Tau441 bi Atto647N hate nîşankirin û 12.5 μM thioflavin-T (ThT) amîloid-taybet ji destpêkê ve hate zêdekirin.malê rengan.Her çend ThT-rengkirina dilopên αS/Tau441 an raftan jî piştî 24 demjimêrên înkubasyonê jî nehate dîtin (Hêl. 5b, rêza jorîn-dilopên mayî li ser raftên proteînê), strukturên ThT-erênî yên ku Atto647N-Tau441 di hundurê raftan de hene pir qels bûn.ev mezinahî, şikil, û cîhê deqên ku berê hatine destnîşan kirin dubare dike (Hêjî. 5b, rêzên navîn û jêrîn), û destnîşan dike ku ew lek bi tevheviyên mîna amyloid-ê yên ku di nav hevokên şilavê yên pîr de çêdibin re têkildar in.
WF 25 μM αS di demên cuda yên înkubasyonê de û bilindahiyên navendê (z, dûrbûna ji binê negirêdayî) bi hebûna 25 μM Tau441 (1 μM αS-aS-ya AF488 û Tau441-ya bi Atto647N) di bîrek plakaya mîkroskopê ya bi tampon LLPS de) .Şeş ceribandinên serbixwe bi encamên heman rengî dubare kirin.b Wêneya mîkroskopî ya CF ya 25 μM αS di hebûna 25 μM Tau441 (1 μM Atto647N-tau441) û 12.5 μM thioflavin-T (ThT).Dilopên proteîna girankirî û raft û deqên proteîna depokirî, bi rêzê, di rêzên jorîn û navîn de têne xuyang kirin.Rêza jêrîn wêneyên raftan nîşan dide û ji 3 dubareyên serbixwe davêje.Tîrên spî di her du panelan de xalên ThT-erênî destnîşan dikin.Bara pîvanê ji bo hemî wêneyan 20 μm ye.
Ji bo ku bi hûrgulî guheztinên di tora proteîna coacervate de di dema derbasbûna ji şilavê berbi hişk vekolin, me wênekêşiya jiyanê ya fluorescence (FLIM) û mîkroskopa veguheztina enerjiyê ya resonansê Förster (FRET) bikar anî (Wêne 6 û Wêneyên Pêvek 8 û 9).Me hîpotez kir ku mazinbûna hevgirtî ya tebeqê di nav avahiyek proteîna berhevkirî ya bêtir kondenskirî an tewra hişktir de dibe sedema têkiliyek nêzîktir di navbera proteîn û sondaya fluorescentê ya pê ve girêdayî ye, ku bi potansiyel bandorek qutkirinê çêdike ku di demek kurtkirî ya lêkolînê de diyar dibe (τ) , wek ku berê hatiye diyarkirin40.,41 ,42.Wekî din, ji bo nimûneyên ducar nîşankirî (AF488 û Atto647N wekî rengên FRET donor û qebûlker, bi rêzê ve), ev kêmbûna τ di heman demê de dikare bi kondensasyona coacervate û zêdebûna karîgeriya FRET (E) di dema LSPT de were hev.Me li ser nimûneyên LLPS αS/Tau441 û αS/ΔNt-Tau (25 μM ji her proteînekê di tamponê LLPS-ê de ku 1 μM AF488 bi αS û/an Atto647N bi Tau441 an ΔNt-Tau nîşankirî ye) bi demê re avakirina raft û xalî şopand.Me meylek gelemperî dît ku dema ku felqên sondajên AF488 (τ488) û Atto647N (τ647N) hinekî kêm dibe (Hêjî. 6 û Hêjîrê. 8c).Balkêş e, ev guhertin ji bo xalên di nav raftan de bi girîngî hate zêdekirin (Wêne. 6c), ku nîşan dide ku li xalan zêdetir kondensasyona proteînê pêk tê.Ji bo piştgirîkirina vê yekê, ji bo dilopên αS/ΔNt-Tau yên ku 24 demjimêran temenê wan 24 demjimêran temen bûne, di temenê floransê de guherînek girîng nehate dîtin (Wêjeya Pêvek. 8d), destnîşan dike ku gêlkirina dilopan pêvajoyek ji nihêrînê cuda ye û bi reorganîzekirina molekularî ya girîng re pê re nayê. di nav coacervates.Divê were zanîn ku xal di αS de xwedî mezinahî û naveroka guhêrbar cihê ne, nemaze ji bo pergala αS/Tau441 (Hêjmara Pêvek. 8e).Kêmbûna temenê floransê ya xalî bi zêdebûna tundiyê re, nemaze ji bo Atto647N bi nîşankirî Tau441 (Hêjêra Pêvek. 8a), û ji bo her du pergalên αS/Tau441 û αS/ΔNt-Tau karîgeriyên FRET bilindtir, ku di pênc demjimêran de LLPS-ê de kondensasyonek din nîşan dide. piştî tehlkirinê, proteînên di hundurê elektrîka statîk de tevlihev dibin.Li gorî αS/ΔNt-Tau, me di deqên αS/Tau441 de nirxên τ647N kêmtir û hinekî bilindtir τ488 dît, ku digel nirxên FRET yên kêmtir û nehomogeneous.Dibe ku ev yek bi vê yekê ve girêdayî be ku di pergala αS/Tau441 de, pirbûna αS ya dîtir û çaverêkirî ya di berhevokan de heterojentir e, bi gelemperî li gorî Tau-yê substoichiometric e, ji ber ku Tau441 bixwe jî dibe ku di bin LLPS û kombûnê de derbas bibe (Hêjmara Pêvek. 8e) .Lêbelê, asta hevgirtina dilopê, damezrandina raftê, û ya girîng, kombûna proteînê di nav hevokên şikil-like dema ku hem Tau441 û hem jî αS hene, herî zêde ye.
Wêneyên mîkroskopa floransê ya Jiyana (FLIM) ya αS/Tau441 û αS/ΔNt-Tau li 25 μM ji her proteînek (1 μM AF488-aS û 1 μM Atto647N-tau441 an ΔNt-Tau) di tampon LLPS de.Stûn di demên cûda yên mezinbûnê de (30 hûrdem, 5 demjimêr û 24 demjimêr) wêneyên nûnerê nimûneyên LLPS nîşan didin.Çarçoveya sor devera ku lekeyên αS/Tau441 dihewîne nîşan dide.Demjimêrên jiyanê wekî barên rengîn têne xuyang kirin.Bara pîvanê = 20 μm ji bo hemî wêneyan.b Wêneya FLIM-ê ya qada hilbijartî ya zoomkirî, ku di qutiya sor a panelê de tê xuyang kirin.Rêjeyên jiyanê bi heman pîvana rengîn wekî di panel a a de têne destnîşan kirin.Bara pîvanê = 5 μm.c Histogramên ku AF488 (girêdayî αS) an Atto647N (girêdayî Tau) nîşan didin ji bo celebên proteîn ên cihêreng (dilopên-D-, raft-R- û speckle-P) ku di wêneyên FLIM-ê yên ku ji bo αS- hatine tomarkirin de hatine nasîn Nimûneyên aS/ΔNt-Tau hevberdanê dikin (N = 17-32 ROI ji bo D, 29-44 ROI ji bo R, û 21-51 ROI ji bo xalan).Nirxên navîn û navîn, bi rêzê, wekî çarçikên zer û xetên reş di hundurê qutiyan de têne destnîşan kirin.Sînorên jêrîn û jorîn ên qutîkê, bi rêzê, çarika yekem û sêyemîn temsîl dikin, û nirxên herî kêm û herî zêde di nav rêza 1,5-qatî interquartile (IQR) de wekî whiskers têne xuyang kirin.Almasên derveyî wekî almasên reş têne xuyang kirin.Girîngiya îstatîstîkî ya di navbera cotên dabeşan de bi karanîna testa t-ya du-nimûneyê hate destnîşankirin, ku cûdahiyên newekhev ferz dike.P-nirxên t-testê yên du dûvik ji bo her cotek daneyên berhevkirî bi stêrkan têne destnîşan kirin (* p-nirx > 0,01, ** p-nirx > 0,001, *** p-nirx > 0,0001, **** p-nirx > 0,00001), ns îhmalkirinê nîşan dide (p-nirx > 0,05).Nirxên rastîn ên p di Tabloya Pêvek 1 de têne dayîn, û daneyên orîjînal wekî pelên daneya xav têne pêşkêş kirin.
Ji bo ku em cewhera mîna amîloidê ya speckles / berhevokan bêtir destnîşan bikin, me 24 demjimêran nimûneyên coacervate yên nerengkirî bi tansiyonên bilind ên (1 M) NaCl derman kirin, ku ev yek bû sedema veqetandina berhevokan ji koacervatên proteîn.Dema ku berhevokên veqetandî (ango, çareseriyek belavkirî ya berhevokan) bi karanîna mîkroskopiya hêza atomê (AFM) hatin dîtin, me morfolojîyek bi giranî ferîkî ya bi bilindahiyek birêkûpêk bi qasî 15 nm dît, ku di şert û mercên giraniya xwê ya bilind de, mîna tevgera fîbrîlên amyloid ên tîpîk ji ber bandora hîdrofobîk a bihêz a li ser rûxê (bala xwe bidin ku fîbrîl bi gelemperî xwedan bilindahiya ~10 nm in) (Hêjmara Pêvek. 10a).Balkêş e, dema ku berhevokên veqetandî bi ThT re di ceribandinek standard a floransê ya ThT de hatin inkub kirin, me zêdebûnek berbiçav a berberiya kuantûmê ya ThT-ya floransê dît, bi ya ku dema ku boyax bi fîbrîlên amyloid ên tîpîk ên αS ve hate înkub kirin re berawirdî dît (Hêjîra pêvek. 10). aggregates coacervate strukturên mîna amyloid hene..Bi rastî, berhevok li hember pîvazên xwê yên zêde tolerans bûn, lê ji 4 M guanidine kloride (GdnHCl) re hesas bûn, mîna fîbrîlên amyloid ên tîpîk (Hêjmara Pêvek. 10c).
Dûv re, me berhevoka berhevokan bi karanîna fluorescence yek molekul, pêwendiya floransê ya taybetî / spektroskopiya pêwendiya xaç (FCS / FCCS), û analîza teqînê ya tespîtkirina hevrêziya du-reng (TCCD) analîz kir.Ji bo vê mebestê, me berhevokên ku piştî 24 demjimêran inkubasyonê di 100 μl nimûneyên LLPS-ê yên ku αS û Tau441 (herdu jî 25 μM) hene, bi hev re bi 1 μM AF488-aS nîşankirî û 1 μM Atto647N-tau441-ya binavkirî, veqetandin.Bi karanîna heman tamponek bê PEG û 1 M NaCl (eynî tampon ku ji bo veqetandina berhevokan ji coacervatê tê bikar anîn) di rewşek monomolekular de çareserîyek belavkirî ya ku derketiye ber bi rewşek monomolekular ve bişoxînin da ku pêşî li têkiliyên elektrostatîk ên gengaz ên di navbera LLPS û proteînê de bigirin.Mînaka trajektora demê ya yek molekulê di jimar 7a de tê dîtin.Analîza FCCS/FCS (pêwendiya xaçerê, CC û xweserî, AC) nîşan da ku berhevokên ku αS û tau tê de hene di nimûneyan de pir bûn (binihêrin kêşeya CC di Fig. 7b, panela çepê de), û zêdebûnek ji proteîna monomerîk a mayî wekî a Encama pêvajoya helandinê (li xêza 7b, panela çepê li kêşeyên AC binêre).Ceribandinên kontrolê yên ku di bin heman şert û mercên çareseriyê de bi karanîna nimûneyên ku tenê proteînên monomerî tê de hatine kirin, çîpên CC-yê nîşan nedan, û kelûpelên AC bi modela belavkirina yek-pêkhatî (Eq. 4) re baş li hev dikin, ku proteînên monomer xwedan rêjeyên belavbûna hêvîdar in (Hêjî. 7b ), panela rastê).Rêjeya belavbûna pariyên kombûyî ji 1 μm2/s kêmtir e, û ya proteînên monomer jî bi qasî 1 μm2/s e.50-100 μm/s;nirx dişibin nirxên berê yên hatine weşandin ji bo fibrîlên aS amyloid ên sonicated û αS monomerîk ji hev veqetandî di bin şert û mercên çareseriyê yên wekhev de44.Dema ku me berhevokên bi analîza teqîna TCCD vekolîn kirin (Wêne. 7c, panela jorîn), me dît ku di her berhevokek veqetandî de (heteroaggregate αS/Tau), ji sedî 60 ji berhevokên ku hatine tespît kirin hem αS û hem jî tau hene, ji sedî 30 tenê tenê tê de heye. tau, bi tenê 10% αS.Analîza stokyometrîkî ya heteroaggregates αS/Tau destnîşan kir ku piraniya heteroaggregates di tau de dewlemend bûne (stoichiometry li jêr 0.5, hejmara navînî ya molekulên tau li ser kombûnê 4 carî ji molekulên αS zêdetir e), ku bi xebata me ya ku di FLIM de di cih de tê dîtin re hevaheng e. ceribandinên..Analîza FRET destnîşan kir ku van berhevokan her du proteînan jî dihewîne, her çend nirxên FRET yên rastîn di vê rewşê de ne girîngiyek mezin e, ji ber ku belavkirina fluorophores di her berhevokê de ji ber zêdebûna proteîna nelakirî ya ku di ceribandinê de hatî bikar anîn random bû.Balkêş e, dema ku me heman analîz bi karanîna 45,46 guhertoya Tau ya kêmbûna kombûna amyloidê ya gihîştî pêk anî (binihêre Hêjmara Pêvek. 11a,b), me dît ku her çend kombûna elektrostatîk αS yek bû (Hêjmara Pêvek. 11c, d), şiyana pêkhatina berhevokan di hundurê coacervate de pir kêm bû û FLIM di ceribandinên li cîh de çend deq tesbît kir, û ji bo nimûneyên berhevokê yên veqetandî kelûpelên hevgirêdana qels hatin dîtin.Lêbelê, ji bo hejmarek piçûk a berhevokên ku hatine tespît kirin (tenê ji dehyek Tau441), me dît ku her kombûnek ji vê guhertoya Tauyê di αS de dewlemend bû, ku bi qasî 50% ji berhevokên hatine tespîtkirin tenê molekulên αS dihewîne, û αS bi zêdeyî heterojen bû. .berhevokan (binêre Hêjmara Pêvek. 11e), berevajî berhevokên heterojen ên ku ji hêla Tau441 ve têne çêkirin (Hêjîrê. 6f).Encamên van ceribandinan destnîşan kirin ku her çend αS bixwe karibe bi tauyê re di nav coacervatê de kom bibe jî, nukleasyona tau di van şert û mercan de xweştir e, û berhevokên mîna amyloid-ê yên ku têne encamdan dikarin wekî formek αS û tau tevbigerin.Lêbelê, gava ku bingehek dewlemend-tau çêbibe, danûstendinên heterotîpîk ên di navbera αS û tau de di berhevokan de li ser danûstendinên homotîpîk ên di navbera molekulên tau de têne pêşwaz kirin;Di heman demê de em toreyên proteîn ên di coacervatên αS/tau yên şil de jî temaşe dikin.
a Nûnertiya şopên demkî yên fluorescentê yên yek molekulên tevheviyên veqetandî yên ku di coacervatên elektrostatîk ên αS/Tau441 de çêdibin.Teqînên ku bi coaggregates αS/Tau441 re têkildar in (teqinên li jor sînorê destnîşankirî) di sê kanalên tespîtê de hatin dîtin (ef488 û Atto647N emeliyata piştî heyecana rasterast, xetên şîn û sor, derketina Atto647N piştî heyecana nerasterast), FRET, xeta binefşî).b Analîzkirina FCS / FCCS ya nimûneyek aS/Tau441 kombûnên veqetandî yên ku ji LLPS (panela çepê) hatine wergirtin.Kûçikên otokorelasyonê (AC) ji bo AF488 û Atto647N, bi rêzê, bi şîn û sor têne xuyang kirin, û kelûpelên hevrêziya (CC) yên ku bi tevheviyên ku her du rengan jî vedigirin bi binefşî têne xuyang kirin.Kevirên AC hebûna celebên proteîna monomerîk û hevgirtî yên binavkirî nîşan didin, dema ku kelûpelên CC tenê belavbûna berhevokên du-labelkirî nîşan didin.Heman analîz, lê di binê heman şert û mercên çareseriyê de yên ku di deqên veqetandî de ne, nimûneyên ku tenê αS monomerîk û Tau441 hene di panela rastê de wekî kontrol têne xuyang kirin.c Analîza fîşa fluoresansê ya molekulên yekane yên berhevokên veqetandî yên ku di hevgirêdanên elektrostatîk ên αS/Tau441 de hatine çêkirin.Agahdariya ji bo her berhevokê ku di çar dubareyên cihêreng de (N = 152) de têne dîtin li hember stoichiometry, nirxên S, û karbidestiya FRET (panela jorîn, barê reng rûdanê nîşan dide) têne xêz kirin.Sê cureyên berhevokan dikarin werin cûda kirin: -aS-tenê berhevokên bi S~1 û FRET~0, berhevokên tenê Tau yên bi S~0 û FRET~1, û berhevokên Tau/αS yên heterojen ên bi S-ya navîn û FRET-ê ​​Texmînên mîqdarê. ji her du proteînên nîşanker ên ku di her berhevokek heterojen de (N = 100) hatine tespît kirin, di panela jêrîn de têne xuyang kirin (pîvana reng rûdanê nîşan dide).Daneyên xav di forma pelên daneya xav de têne peyda kirin.
Pîvanbûn an pîrbûna kondensasyonên proteîna şil di nav strukturên gêlê-wek an hişk de bi demê re hate ragihandin ku di gelek fonksiyonên fîzyolojîk ên kondensatê47 de û her weha di nexweşiyê de, wekî pêvajoyek anormal a ku pêşî li berhevkirina amyloidê digire 7, 48, 49. Li vir em veqetandina qonaxê û tevgerê bi hûrgulî lêkolîn dikin.LSPT αS di hebûna polîkasyonên bêserûber de li hawîrdorek kontrolkirî di tansiyonên mîkromolar ên kêm û şert û mercên têkildar ên fîzyolojîkî de (bala xwe bidin ku giraniya fîzyolojîkî ya hesapkirî ya αS> 1 μM50 e), li dû tevgera tîpîk a LPS-ê ku bi termodînamîka rêve dibe.Me dît ku αS, ku di pH-ya fîzyolojîk de herêmek C-termînalê ya pir negatîv barkirî dihewîne, di nav pêvajoya elektrostatîk de di hebûna peptîdên bêserûber ên pir kationîk ên wekî pLK an Tau de bi riya LLPS-ê dikare dilopên proteîn-dewlemend di çareseriya avî de çêbike. di hebûna makromolekulên kombûnê de kondensasyona tevlihev.Dibe ku ev pêvajo di hawîrdora hucreyî de bandorên têkildar hebe ku αS bi molekulên polîkationîk ên cihêreng ên ku bi tevhevbûna xwe ya bi nexweşiyê ve girêdayî hem in vitro û hem jî di vivo51,52,53,54 ve girêdayî re rûbirû dibe.
Di gelek lêkolînan de, dînamîkên proteîn ên di nav dilopan de wekî yek ji faktorên bingehîn ên ku pêvajoya mazinbûnê diyar dike têne hesibandin55,56.Di aS-ya elektrostatîk de bi polîkatîyonan re hevrû dibin, pêvajoya mazinbûnê eşkere bi hêza danûstendinên bi polycationan re, valence, û pirbûna van têkiliyan ve girêdayî ye.Teoriya hevsengiyê pêşniyar dike ku perestgehek hevsengiya du rewşên şil dê hebûna dilopek mezin a dewlemend bi biyopolîmeran be ku LLPS57,58 dimeşîne.Mezinbûna dilopan dikare bi mazinbûna Ostwald59, hevgirtin60 an vexwarina monomera belaş di qonaxa belavbûyî de pêk were61.Ji bo αS û Tau441, ΔNt-Tau an pLK, piraniya proteînê di bin şert û mercên ku di vê lêkolînê de hatine bikar anîn di kondensatê de hate berhev kirin.Lêbelê, dema ku dilopên tau-yê yên bi mezinahî zû li ser şilbûna rûkalê zû li hev dicivin, hevgirtin û şilbûna dilopan ji bo ΔNt-Tau û pLK-ê dijwar bû, ku di van her du pergalan de windabûna bilez a taybetmendiyên şilavê pêşniyar dike.Li gorî analîza meya FLIM-FRET, dilopên pLK û ΔNt-Tau yên temen astek berhevbûna proteînê (jiyana floransê ya wekhev) wekî dilopên orîjînal nîşan didin, û destnîşan dikin ku tora proteîna orîjînal tê parastin, her çend hişktir be.
Em encamên ceribandina xwe di modela jêrîn de maqûl dikin (Wêne 8).Dilopên ku di destpêkê de bi demkî têne çêkirin bi gelemperî torên proteîn in bêyî tezmînata elektrostatîk, û bi vî rengî deverên bêhevsengiya barkirinê hene, nemaze di navbera dilopê de, di encamê de dilopên bi potansiyela rûkala elektrostatîk a bilind çêdibin.Ji bo telafîkirina barkirinê ( diyardeyek ku bi gelemperî wekî kêmbûna valenceyê tê binav kirin) û kêmkirina potansiyela rûkalê ya dilopan, dilop dikare polîpeptîdên nû yên ji qonaxa dilşikestî bihewîne, torên proteînan ji nû ve organîze bike da ku danûstendinên bar-barê xweştir bike, û bi dilopên din re têkilî daynin.bi rûberan (şilbûn).Dilopên αS/pLK, ji ber tora xweya proteînê ya hêsan (tenê danûstendinên heterotîpîk ên di navbera αS û pLK de) û pêwendiya zêde ya ji bo danûstendinên proteîn-proteîn, wusa dixuye ku dikarin zûtirîn barkirina kondensatê hevseng bikin;bi rastî, me kînetîkên proteînê yên zûtirîn di nav aS/pLK de coacervatên ku di destpêkê de hatine çêkirin de ji αS/Tau dît.Piştî kêmbûna valenceyê, danûstendin kêm kêm dibe û dilop taybetmendiyên xwe yên şil winda dikin û dibin dilopên gêlê-şewitandinê yên bi potansiyela rûkala elektrostatîk a kêm (û ji ber vê yekê nekarin rûxê şil bikin).Berevajî vê, dilopên αS/Tau di xweşbînkirina balansa barkirina dilopê de ji ber torên proteîn ên tevlihevtir (bi hem têkiliyên homotîpî û hem jî heterotîpîk) û xwezaya qels a danûstendinên proteînê kêmtir bikêr in.Ev dibe sedema dilopên ku ji bo demên dirêj behreya şilê diparêzin û potansiyelek rûkala elektrostatîk a bilind nîşan didin ku ji hêla hevgirtin û mezinbûnê ve kêm dibe (bi vî rengî rêjeya rûber / volga dilopan kêm dike) û bi şilkirina kîmyewî ya rûyê hîdrofîlîk.Ev pirtûkxaneyên proteînên mezin ên konsantrekirî diafirîne ku taybetmendiyên şilavê diparêze ji ber ku têkilî ji ber lêgerîna domdar a xweşbîniya barkirinê di tora proteînê de pir derbasdar dimînin.Balkêş e, formên qutkirî yên N-dawî yên Tau, di nav de hin îzoformên xwezayê62 jî hene, tevgerek navbirî nîşan didin, digel ku hin hevberdan bi αS-ê di nav dilopên gêlê-dirêj ên demdirêj de pîr dibin, hinên din jî vediguherin kondensasyonên şil ên mezin.Ev dualîtî di mezinbûna aS coacervatên elektrostatîk de bi lêkolînên teorîk û ceribandî yên LLPS-ê yên vê dawiyê re hevaheng e ku têkiliyek di navbera kêmbûna valenceyê û sivikkirina elektrostatîk de di kondenseyan de wekî mifteyek ji bo kontrolkirina mezinahiya kondensatê û taybetmendiyên şilavê nas kiriye.Mekanîzmaya 58.61.
Ev nexşe rêça berhevkirina amyloidê ya gumanbar ji bo αS û Tau441 bi LLPS û LSPT ve nîşan dide.Digel deverên din ên dewlemend-anyon (sor) û dewlemend-kation (şîn), coacervatên elektrostatîk ên αS û tau yên bi valentiya têrker xwedan enerjiya rûkalê kêmtir in û ji ber vê yekê hevgirtinek hindiktir heye, ku di encamê de pîrbûna dilopê bi lez çêdibe.Dewletek gêlê ya ne-aglomerated a stabîl tê bidestxistin..Ev rewş di mijara pergala αS/pLK de ji ber pêwendiya wê ya bilind û tora pêwendiya proteîn-cotê hêsan, ku rê dide veguheztinek mîna gel-a bilez, pir xweş e.Berevajî vê, dilopên bi valentiya nerazî û, ji ber vê yekê, deverên proteîn-barkirî yên ku ji bo pêwendiyê peyda dibin, hêsantir dike ku coacervate li ser rûyê hîdrofîlîk bişewitîne û şil bike da ku enerjiya rûkala wê ya bilind kêm bike.Ev rewş ji bo coacervatên αS/Tau441, yên ku xwedan torgilokek tevlihev a pirvalent e ku ji danûstendinên Tau-Tau û αS-Tau yên qels pêk tê, tercîh e.Di encamê de, coacervatên mezin dê bi hêsanî taybetmendiyên xwe yên mîna şilî bihêlin, ku rê dide danûstendinên proteîn-proteîn ên din çêbibin.Di dawiyê de, berhevokên heterojen ên amyloid ên ku hem αS û hem jî tau hene, di hundurê şilava coacervate de çêdibin, ku dibe ku bi yên ku di laşên tevlêbûnê de têne dîtin, yên ku nîşanên nexweşiyên neurodejenerative ne ve girêdayî bin.
Avahiyên mezin ên mîna şilavê yên ku di dema mazinbûna αS/Tau441 de bi hawîrdorek proteînek pir qelebalix lê dînamîk pêk hatine û, hindiktir, aS/ΔNt-Tau coacervates depoyên îdeal in ji bo nûjenkirina kombûna proteînê.Bi rastî me dît ku pêkhatina proteînên zexm di vî celebê hevberdana proteînan de, ku bi gelemperî hem αS û hem jî tau hene, dîtiye.Me destnîşan kir ku van heteroaggregates ji hêla danûstendinên ne-elektrostatîk ve têne stabîl kirin, dikarin rengên ThT-amyloîd-taybetî bi heman rengî wekî fîbrîlên amyloid ên tîpîk ve girêbidin, û bi rastî jî xwedan berxwedanek wekhev in ji bandorên cihêreng.Tevheviyên αS/tau yên ku ji hêla LLPS ve hatî çêkirin, xwedan taybetmendiyên amyloid-ê têne destnîşan kirin.Bi rastî, guhertoya gihîştî ya Tau ya ku di berhevkirina amyloidê de kêm dibe di avakirina van kombûnên αS-ya heterojen de di hundurê coacervata elektrostatîk a şil de pir kêm dibe.Çêbûna aS/Tau441 aggregates tenê di hundurê coacervates de hate dîtin, ku taybetmendiyên şikilî diparêzin, û tu carî, ger ku coacervates / dilop negihîjin rewşa gêlê.Di rewşa paşîn de, hêza zêde ya danûstendinên elektrostatîk û, wekî encamek, hişkiya tora proteînê rê li ber vesazkirinên konformasyonê yên hewce yên proteînan digire da ku danûstendinên proteînên nû yên ku ji bo nucleasyona amyloidê hewce ne saz bikin.Lêbelê, ev dikare di navhevokên maqûltir, şil-wek de, ku di encamê de îhtîmal e ku her ku mezinahiya wan zêde dibin de şil bimînin.
Rastiya ku pêkhatina berhevokan di hundurê qonaxa kondensasyonê de di kondensasyonên αS/Tau yên mezin de ji dilopên piçûk ên ku bi lez çêdibin çêtir e, girîngiya naskirina faktorên ku hevgirtina dilopan kontrol dikin ronî dike.Ji ber vê yekê, ne tenê meylek ji bo veqetandina qonaxê heye, lê mezinahiya kondensatê jî ji bo fonksiyona rast û hem jî pêşîgirtina nexweşiyê divê were kontrol kirin58,61.Encamên me di heman demê de girîngiya hevsengiya di navbera LLPS û LSPT de ji bo pergala αS / Tau jî ronî dikin.Digel ku çêkirina dilopan dikare li dijî berhevbûna amîloidê biparêze bi kêmkirina mîqdara monomerên proteîn ên ku di bin şert û mercên têrbûnê de peyda dibin, wekî ku di pergalên din de hatî pêşniyar kirin63,64, hevgirtina dilopan di astên dilopê yên bilind de dibe ku bi vesazkirinên konformasyonê yên hêdî ve bibe sedema kombûna proteîna hundurîn.torên proteîn..
Bi tevayî, daneyên me bi tundî girîngiya valahiya hevgirtî û danûstendinên razî / ne razî di torên dakêşanê de di çarçoweya LSPT de tekez dikin.Bi taybetî, em destnîşan dikin ku kondensasyonên tev-dirêj ên αS/Tau441 dikarin bi rengekî bikêrhatî tevbigerin û navokî bikin da ku heteroaggregates-mîna amyloid-ê ku hem proteînan dihewîne pêk bînin û hem jî li ser bingeha encamên ceribandina me mekanîzmayek molekulî pêşniyar dikin.Hevberhevkirina du proteînan di hevberdana şilavê ya αS/Tau de ku em li vir radigihînin, dibe ku bi rastî bi hevrêziya du proteînan re têkildar be, ku nîşanên nexweşiyê ne, û dibe ku beşdarî têgihîştina têkiliya di navbera LLPS û kombûna amyloid, di neurodejenerasyonê de rê li ber IDP-ya pir bargiran vedike.
WT-αS monomerîk, mutantên cysteine ​​(Q24C-αS, N122C-αS) û guhertoyên ΔCt-αS (Δ101-140) di E. coli de hatin diyar kirin û wekî ku berê hatî destnîşan kirin hate paqij kirin.5 mM DTT di hemî gavan de di paqijkirina mutantên aS cysteine ​​de hate girtin da ku pêşî li avakirina girêdana dîsulfîdê bigire.Îzoforma Tau441 (plazmîda ku ji Addgene #16316 hatiye wergirtin), guhertoya ΔNt-Tau (Δ1-150, ku bi klonkirina IVA-yê bi primerên CTTTAAGAAGGAGAGAGATACATATGATCGCCACACCCGCGG, CATATGTATATCCTCTTCTTAAAAGTAAACGCGG, CATATGTATATCCTCTTCTTAAAAGTAAACT, 5-AggDACCTCTTCTTAAAAGTAAACTaq-2-5-AggDACTACTAGTAGTAAACTau3,5-AggDACTAGD2-5-Aggantpur3D1-5-Aggantpur3D1. destpêk) çandên E. coli bûn OD600 = 0.6-0.7 li 37 ° C û 180 rpm mezin bû, û bi IPTG 3 demjimêran di 37 ° C de vegotin.Xaneyên di 11,500 xg de ji bo 15 deqîqeyan di 4 °C de hilînin û bi tampon şor a ku 150 mM NaCl vedihewîne bişon.Pelê di tampon lîzê de ji nû ve rawestînin (20 ml li 1 L LB: MES 20 mM, pH 6.8, NaCl 500 mM, EDTA 1 mM, MgCl2 0.2 mM, DTT 5 mM, PMSF 1 mM, benzamidîn 50 μptin μM, cope).Pêngava sonîkasyonê li ser qeşayê bi amplitudeya% 80 ji bo 10 pêlşan (1 hûrdem, 1 hûrdem dûr) hate kirin.Di yek ultrasoundê de 60 ml zêdetir neke.Lîzên E. coli 20 hûrdeman di 95°C de hatin germ kirin, paşê li ser qeşayê sar kirin û 40 hûrdeman di 127,000×g de santrîfuj kirin.Spernatantê zelalkirî li parzûnek 3,5 kDa hate sepandin (Spectrum™ Thermo Fisher Scientific, UK) û li hember 4 L tampona dialîzê (20 mM MES, pH 6,8, NaCl 50 mM, EDTA 1 mM, MgCl2 2 mM, DTT hate dialîz kirin. , PMSF 0.1 mM) ji bo 10 saetan.Stûnek pevguhertina kationê ya 5 ml (HiTrap SPFF, Cytiva, MA, USA) bi tamponek hevsengiyê (20 mM MES, pH 6.8, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA, 2 mM MgCl2, 2 mM DTT, 0.1 mM PMSF) hate hevseng kirin.Tau lysate di nav parzûnek PVDF ya 0,22 μm de hate parzûn kirin û bi rêjeya herikîna 1 ml/min di stûnê de hate derzî kirin.Elution hêdî hêdî hate kirin, tau bi 15-30% tampon elutionê (20 mM MES, pH 6.8, 1 M NaCl, 1 mM EDTA, 2 mM MgCl2, 2 mM DTT, 0.1 mM PMSF) hate avêtin.Parçeyên ku ji hêla SDS-PAGE ve têne analîz kirin, û her perçeyên ku yek band bi giraniya molekulê ya tau ya çaverêkirî vedihewîne bi karanîna parzûnek 10 kDa ya santrîfujê hate berhev kirin û bi tamponek ku tê de 10 mM HEPES, pH 7.4, NaCl 500 mM û DTT 2 mM tê de hate veguheztin. giraniya proteîna paşîn 100 μM bû.Dûv re çareseriya proteînê ji parzûnek PVDF ya 0,22 μm derbas bû, zû hate cemidandin û di -80 °C de hate hilanîn.Protein K18 bi dilovanî ji hêla Prof. Alberto Boffi ve hate peyda kirin.Paqijiya amadekariyê ji hêla SDS-PAGE û MALDI-TOF/TOF ve hatî pejirandin> 95% bû.Cîsteînên cihêreng bi kîmyewî bi AlexaFluor488-maleimide (AF488, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA) an TEMPOL-maleimide (Toronto Research Chemicals, Toronto, Kanada) hatine nîşankirin.ji hêla absorbance û MALDI-TOF/TOF ve hatin pejirandin.Tau441, ΔNt-Tau, AggDef-Tau û K18 li cihên 191 û 322 bi karanîna Atto647N-maleimide (ATTO-TEC GmbH, Siegen, Almanya) bi bermahiyên cysteine ​​yên xwemalî li dû heman prosedurê hatine nîşankirin.Nexşeya bermayiyê ji bo αS û Tau441 bi karanîna CIDER66 ve hatî çêkirin.
Poly-L-lysine hişk (pLK DP 90-110 li gorî NMR ji dabînkerê, Alamanda Polymers Inc, Huntsville, Alabama, USA) di 10 mM HEPES, 100 mM NaCl, pH 7,4 heta 10 mM de hate hilweşandin, pêvajo ji bo 5 sonicated. deqeyan di hemamek avê ya ultrasonic de û li -20 °C hilînin.PEG-8, dextran-70, FITC-PEG-10 (Biochempeg, Watertown, MA, USA) û FITC-dextran-500 (Sigma -Aldrich, Sant Louis, MI, USA) di avê de çareser dibin û bi berfirehî di tampon LLPS de têne belav kirin.Diyalîz xwêyên qirêj jê dike.Dûv re ew di nav parzûnek sirincek bi mezinahiya porê 0,22 μm de hatin fîltrekirin, û giraniya wan bi karanîna refraktometre (Mettler Toledo, Columbus, Ohio, DY) hate hesibandin.Nimûneyên LLPS li germahiya odeyê bi rêza jêrîn hatin amadekirin: tampon û extrusion tevlihev bûn û 1 mM tris (2-karboksîetîl) fosfîn (TCEP, Carbosynth, Compton, UK), 1 mM 2,2,2,2-(Etan- 1, 2-diyldinitrile) asîda tetraacetîk (EDTA, karboksînth) û têkelek ji %1 înhîbîtorê protease (PMSF 100 mM, benzimîd 1 mM, leupeptin 5 μM).Dûv re αS û polycations fused (vebijarkên pLK an Tau) têne zêdekirin.Ji bo ceribandinên rêzikên demkî yên thioflavin-T (ThT, Carbosynth, Compton, UK), tevhevbûna ThT bikar bînin ku nîvê giraniya αS be.Bi nermî lê bi baldarî nimûneyan tevlihev bikin da ku ew homojen in.Kêmbûna her pêkhateyê ji ceribandinê heya ceribandinê diguhere, wekî ku di beşa Encaman de hatî destnîşan kirin.Gava ku dema ceribandinê ji 4 demjimêran derbas bû, azide bi giraniya 0,02% (w/v) hate bikar anîn.Ji bo hemî analîzên ku nimûneyên LLPS bikar tînin, bihêlin ku tevlihev berî analîzê 5 hûrdem hevseng bibe.Ji bo analîza belavbûna ronahiyê, 150 µl nimûneyan li mîkroplateyên 96-kanî yên negirêdayî (µClear®, reş, F-Bottom/Cimney Well, Greiner bio-one, Kremsmünster, Avusturya) hatin barkirin û bi fîlima adhesive ve hat girtin.LLP bi pîvandina vegirtinê li 350 nm li navenda çareseriyê di xwendevanek plakaya CLARIOstar de (BMG Labtech, Ortenberg, Almanya) hate şopandin.Ceribandin di 25°C de sê caran hatin kirin, û xeletî wekî veqetîna standard ji navgîniyê hatin hesibandin.Qonaxa dilteng bi santrîfujkirina nimûneyê û analîza gêlê ya SDS-PAGE ve hate pîvandin, û beşa αS di qonaxên dirûv û konsantrekirî de di çareseriyên cihêreng ên LLPS de hate hejmartin.Nimûneyek LLPS ya 100 μl ya ku tê de 1 μM AF488-aS nîşankirî heye, bi tevlihevkirina tevhev û dûv re santrîfugasyon li 9600 × g ji bo 30 hûrdeman hate amade kirin, piştî ku tîrêj bi gelemperî xuya bû.50 μl ya jorîn a supernatant ji bo pîvandina proteînê bi karanîna gêla SDS-PAGE hate bikar anîn.Gel bi parzûnên AF488 ve bi karanîna pergalek wênegiriya jelê ya ChemiDoc (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA) hatin pîskirin an jî bi reng Coomassie ve hatin xemilandin û bi fîlterên guncan ve hatin xuyang kirin.Bendên encam bi karanîna guhertoya ImageJ 1.53i (Enstîtuya Tenduristiyê ya Neteweyî, DY) hatin analîz kirin.Ezmûn di du ceribandinên cûda de bi encamên wekhev re ducar hatin kirin.
Bi gelemperî, 150 μl ji nimûneyan li mîkroplateyên 96-kalê yên ne-girêdayî hatin sepandin û li germahiya odeyê li ser mîkroskopa berevajîkirî Leica DMI6000B (Leica Microsystems, Wetzlar, Almanya) hatin dîtin.Ji bo ceribandinên deqê, lewheyên Angiogenesis μ-Slide (Ibidi GmbH, Gräfelfing, Almanya) an jî mîkropûleyên polistirenê yên 96-kanî (Corning Costar Corp., Acton, Massachusetts) hatin bikar anîn.EL6000 lampayên halojen an halîdê metalê yên merkur wekî çavkaniyên ronahiyê hatin bikar anîn (bi rêzdarî ji bo wênekirina BF/DIC û WF).Ji bo mîkroskopiya WF, armancek hewayê ya 40x mezinkirin (Leica Microsystems, Almanya) hate bikar anîn da ku ronahiyê li ser nimûneyê bisekine û wê berhev bike.Ji bo nimûneyên bi etîketkirî AF488 û ThT, bi rêzê ve fîlterên parzûnê yên 460-500 nm û 512-542 nm, û neynikek dîkroîkî ya 495 nm, bi rêzikên parzûna GFP-ya standard, fîlterên bandpassê yên heyecan û belavkirinê, fîlterkirin û belavbûna fîlterê.Ji bo nimûneyên ku bi Atto647N hatine nîşankirin, komek standard ji parzûnên Cy5 yên bi parzûnên bandpassê yên 628-40 nm û 692-40 nm, bi rêzê ve, bi 660 nm û neynek dîkroîkî ya 660 nm hatine bikar anîn.Ji bo mîkroskopiya BF û DIC, heman armanca berhevkirina ronahiya ronîkirî bikar bînin.Ronahiya berhevkirî li ser kamera Leica DFC7000 CCD (Leica Microsystems, Almanya) hate tomar kirin.Ji bo wênekêşiya mîkroskopî ya BF û DIC 50 ms û ji bo nîgarkirina mîkroskopiya WF 20-100 ms bû.Ji bo berhevdanê, dema xuyangê ya ji bo hemî ceribandinên bi ThT 100 ms bû.Ji bo dîtina hevgirtina dilopan azmûnên demdirêj hatin kirin, digel ku wêne her 100 ms ji bo çend hûrdeman têne berhev kirin.ImageJ (NIH, USA) ji bo analîzkirina wêneyê hate bikar anîn.Ezmûnên sê caran bi encamên wekhev hatin kirin.
Ji bo ceribandinên hevberdanê, FRAP û ji nû veavakirina 3D, wêne li ser mîkroskopa konfokal a berevajîkirî Zeiss LSM 880 bi karanîna çapek şîn a ZEN 2 (Carl Zeiss AG, Oberkochen, Almanya) hatin bidestxistin.Nimûneyên 50 μl li firaxên μ-Slide Angiogenesis Petri (Ibidi GmbH, Gröfelfing, Almanya) hatin sepandin, bi polîmerek hîdrofîlîk (ibiTreat) hatin derman kirin û di armancek 63× daxistina rûnê (Plan-Apochromat 63×/NA 1.4 Oil) li ser DIC).Wêneyên bi 458 nm, 488 nm, û 633 nm xêzên lazerê yên argonê yên bi reso û 638-755 nm ji bo dîtina ThT, AF488 û Atto647N, bi rêzê ve hate bikar anîn.Ji bo ceribandinên FRAP-ê, wênekêşiya demdirêj a her nimûneyê bi 1 çarçoveyek di çirkeyê de hate tomar kirin.Ceribandin li germahiya odeyê sê caran bi encamên heman rengî hatin kirin.Hemî wêne bi karanîna nermalava çapa şîn a Zen 2 (Carl Zeiss AG, Oberkochen, Almanya) hatin analîz kirin.Kevirên FRAP-ê hatin normalîzekirin, xêzkirin û li gorî daneyên zexm/demê ku ji wêneyên ku Zen 2 bi karanîna OriginPro 9.1-ê bikar tînin hatine derxistin, hatine çêkirin.Kevirên vejenê li modelek yek-berfireh hatin bicîh kirin da ku belavkirina molekulî bi termek pêvekêşanê ya zêde ve were hesibandin da ku bandora şînbûna wergirtinê were hesibandin.Dûv re me D bi karanîna tîrêjê spîkirina binavkirî û nîv-jiyana vegerandina berê hatî destnîşan kirin wekî hevkêşeya Kang et al.5 35 tê nîşandan.
Guhertoyên cysteine ​​yên yekane yên αS bi 4-hîdroksî-2,2,6,6-tetramethylpiperidine-N-oxyl (TEMPOL) li cihên 24 (TEMPOL-24-αS) û 122 (TEMPOL-122-αS) hatin sentez kirin, herwiha.Nîşankirina Spin Ji bo ceribandinên EPR, hûrbûna αS li 100 μM hate danîn û giraniya PEG% 15 (w / v) bû.Ji bo şert û mercên cûda yên berhevkirinê, rêjeya αS: pLK 1:10 bû, dema ku rêjeyên αS:ΔNt-Tau û αS:Tau441 di 1:1 de hatin parastin.Ji bo ceribandinên titrasyonê yên girêdanê di nebûna qelebalixiyê de, TEMPOL-122-αS li 50 μM hate parastin û polikasyon di zêdekirina tansiyonê de hatin tîtir kirin, her şert ji hev cuda amade kirin.Pîvandinên CW-EPR bi karanîna spektrometerek Bruker ELEXSYS E580 X-band ku bi resonatorek Bruker ER4118 SPT-N1 ve hatî çêkirin li frekansa mîkropêl (SHF) ya ~ 9,7 GHz tê xebitandin.Germahiya li 25 ° C hate danîn û ji hêla kryostatek nîtrojenê ya şil ve hate kontrol kirin.Spektra di bin şert û mercên ne têrbûyî de bi hêzek MW 4 mW, amplituda modulasyonê 0,1 mT, û frekansa modulasyonê 100 kHz hatine bidestxistin.Zehmetiyên spektral normalîze bûn da ku ji cûdahiyên di hûrguliyên spinê de di navbera nimûneyan de û kêmkirina spinê ya gengaz ji ber tansiyonên mayî yên kêmkerên di nimûneyên ku Tau441 an ΔNt-Tau hene (di çareseriyên proteîna orîjînal de hene) neyên normalîzekirin.Nirxên diyarkirî yên g di encama modela spektralê ya EPR de ku bi karanîna nermalava Easyspin (v. 6.0.0-dev.34) hatî bicîh kirin di Matlab®67 de hatî çêkirin, hatine wergirtin.Modelên îzotropîk ên yek / du pêkhatî ji bo modela daneyê hatine bikar anîn.Piştî normalîzekirina hemî nîşanan, bermayiyan bi derxistina her simulasyonek ji spektora ceribandinê ya têkildar ve hatin hesibandin.Ji bo analîza titrasyona girêdanê, tundiya têkildar a bandê sêyem ji koma duyemîn a spekrûma EPR-ya normalîzekirî (IIII/III) hate bikar anîn da ku girêdana polikasyonên bi αS-ê bişopîne.Ji bo texmînkirina domdariya veqetandinê (Kd), kêşeya encam li modelek nêzikî ku n cîhên girêdanê yên wekhev û serbixwe vedihewîne hate bicîh kirin.
Ceribandinên spektroskopiya NMR bi karanîna spektrometerek NMR ya Bruker Neo 800 MHz (1H) ku bi kryoprobe û Z-gradient ve hatî çêkirin, hatin kirin.Hemî ceribandin bi karanîna 130-207 μM αS û hevkêşeyên αS/ΔNt-Tau û pLK-ê yên têkildar di 10 mM HEPES, 100 mM NaCl, 10% DO, pH 7.4 de hatin kirin û li 15 °C hatin kirin.Ji bo çavdêriya LPS-ê ji hêla NMR ve, 10% PEG li nimûneyên pêş-tevlihevkirî hate zêdekirin.Pîvana têkçûna veguheztina kîmyewî (Hêjîra 1b) guheztinên kîmyewî yên navînî 1H û 15N nîşan dide.Spektrên αS 2D1H-15N HSQC li ser bingeha peywirek berê (BMRB ketina #25227) hatin veqetandin û bi tomarkirin û analîzkirina spekterên 3D yên HNCA, HNCO û CBCAcoNH ve hatin pejirandin.Veguheztinên kîmyewî 13Cα û 13Cβ di hebûna ΔNt-Tau an pLK de hatin hesibandin da ku guheztinên gengaz ên di meylên strukturên duyemîn de li gorî veguheztinên kîmyewî αS-ê di konformasyona 68-ê ya paqij a rasthatî de bipîvin (Wêneya Pêvek 5c).Rêjeyên R1ρ bi tomarkirina ceribandinên hsqctretf3gpsi (ji pirtûkxaneya Bruker hatine wergirtin) bi derengiyên 8, 36, 76, 100, 156, 250, 400, û 800 ms hatine pîvandin, û fonksiyonên berbiçav li lûtkeyê di gelek cûda de hatine sererast kirin. caran ji bo destnîşankirina R1ρ û nezelaliya wê ya ceribandinê.
Ceribandinên mîkroskopî yên floransê yên du reng-dem-çareserkirî li ser mîkroskopek konfokal a floransansê ya MT200-ê ya bi wext-çareserkirî ya bazirganî (PicoQuant, Berlîn, Almanya) bi amûrek jimartina fotonê ya yekalî ya bi demê re (TCSPC) ve hatin kirin.Serê dîoda lazerê ji bo heyecana navberkirî ya pêlsî (PIE) tê bikar anîn, tîrêj di rêgezek pêlek moda yekane re derbas dibe û ji bo xetên lazerê yên 481 nm û 637 nm yên ku piştî neynek dîkroîkî têne pîvandin bi hêzek lazerê ya 10 heta 100 nW tê guheztin.Ev rêjeyek jimartina fotonê ya çêtirîn misoger dike, ji bandorên aliasing photon, photobleaching û saturation dûr dikeve.Pîvan an lewheyên angiogenesis μ-Slide (Ibidi GmbH, Gräfelfing, Almanya) rasterast di nav ava şilandinê de li ser lensek Super Apochromat 60x NA 1.2 bi stûyê rastker hatin danîn (Olympus Life Sciences, Waltham, USA).Neynek dîkroîkî ya 488/640 nm (Semrock, Lake Forest, IL, USA) wekî dabeşkera tîrêjê ya sereke hate bikar anîn.Radyoya bêserûber ji hêla qulikek bi dirêjahiya 50 mîkronan ve tê asteng kirin, dûv re tîrêjên baldar bi dabeşkerek tîrêjê 50/50 li 2 rêyên tespîtê tê dabeş kirin.Parzûnên belavbûna bandpass (Semrock, Lake Forest, IL, USA) 520/35 ji bo boyaxa kesk (AF488) û 690/70 ji bo boyaxa sor (Atto647N) li ber dedektorê hatine bikar anîn.Dîodên avalanche yên yek-foton (SPAD) (Alavên Micro Photon, Bolzano, Italytalya) wekî dedektor hatin bikar anîn.Hem berhevkirina daneyan û hem jî analîzkirin bi karanîna nermalava bazirganî ya SymphoTime64 (PicoQuant GmbH, Berlîn, Almanya) ve hatî peyda kirin.
Pênc mîkrolître nimûneyên LLPS li bîrên angiogenesis μ-Slide (Ibidi GmbH, Gräfelfing, Almanya) hatin sepandin.Wêneyên ku têne encamdan 20 μm li jor li binê bîrê têne balkişandin ji bo dûrahiya xebata armancê ya çêtirîn ji bo dilopên rawestandî û heya ~ 1 μm ji bo raft û xalên bi resala axial ya herî kêm 0,25 μm / pixel û dema derengmayînê 400 μs / pixel.Daneyên bi sepandina bendek tundûtûjiyê li ser bingeha tundiya nîşana paşerojê ya navîn (PBG, navgîn + 2σ) ji bo her kanalek hilbijêrin, da ku tenê dilopên proteîna şirîn, raft, an deq werin hilbijartin, û her eslê gengaz ji qonaxa belavbûyî fîlter bikin.Ji bo analîzkirina temenê her cure (τ) ya her kanalê (kesk, "g" ji bo AF488 û sor, "r" ji bo Atto647N), me herêmên balkêş (ROI) yên ku dilop, raft, an deq hene hilbijart (Wêneya Pêvek 1). ).8b) û wan bi guncavkirina rizîbûna jiyana wan (τD, τR û τP bi rêzê, ji bo dilop, raft an deqan, binihêrin Pêvek Fig. 8c) di her kanalê de bi karanîna analîzek dûvikê û modela rizîbûnê ya du-pêkhatî.Average τ ji τ.ROI-yên ku ji bo guncanek pir-hejmarî pir hindik foton hilberandin ji analîzê hatin derxistin.Rêjeya ku hatî bikar anîn <104 foton ji bo raft û xalan û 103 ji bo dilopan bû.Dilop xwedan bendek nizmtir in ji ber ku dijwar e ku meriv kelûpelên rizîbûnê bi nirxên tundî yên bilindtir bi dest bixe, ji ber ku dilopên di qada wêneyê de bi gelemperî piçûktir û kêmjimar in.ROI-yên bi hejmarên fotonê li ser sînorê berhevkirina fotonê (ji 500 hejmartin / pixel hatî danîn) jî ji bo analîzê hatin avêtin.Ji destpêka jiyana karûbarê kêşeya rizîbûnê ya ku ji herêma berjewendiyê hatî wergirtin bi tundîyek ji% 90 ya herî zêde (hinek piştî tundiya herî zêde ya hilweşînê) bi hev re bidin hev da ku destwerdana IRF ya hindiktirîn misoger bike û di heman demê de ji bo hemî hilweşîna tundûtûjiyê heman bimîne. mîhengên Pencereya dema têkildar Ji 25 heta 50 ROI ji bo raft û deqan û 15-25 ROI ji bo dilopan hatin analîz kirin, wêneyên ji zêdetirî 4 dubareyan hatine hilbijartin ku ji herî kêm 3 ceribandinên serbixwe hatine tomar kirin.Ji bo nirxandina ciyawaziyên îstatîstîkî yên di navbera cureyan de an jî di navbera pergalên coacervate de testên t-ya du-piştî hatine bikar anîn.Ji bo analîzek pixel-bi-pixel a heyamê (τ), kêmbûna tevahî ya jiyanê li ser zeviyê ji bo her kanalê hate hesab kirin û nêzîkatiyek ji modelek kêmbûna 2/3-pêkhatî hate pêkanîn.Dûv re kêmbûna jiyanê ji bo her pixelê bi karanîna nirxên τ yên berê hatine hesibandin hate bicîh kirin, û di encamê de wêneyek FLIM-ê ya pseudoreng bû.Rêjeya jiyana dûvikê di hemî wêneyên heman kanalê de yek bû, û her rizîbûn têra xwe foton hildiberand ku pêbaweriyek pêbawer peyda bike.Ji bo analîza FRET, pîxel bi sepandina bendek tundûtûjiya kêmtir a 100 fotonan, ku navgînek nîşanek paşerojê (FBG) ya 11 fotonan digire, hatin hilbijartin.Hêza floransê ya her kanalê ji hêla faktorên rastkirinê yên bi ceribandinê ve hatî destnîşan kirin ve hate rast kirin: 69 xaça spektral α 0.004 bû, vekêşana rasterast β 0.0305 bû, karbidestiya tespîtkirinê γ 0.517 bû.Dûv re karbidestiya FRET di asta pixel de bi karanîna hevkêşeya jêrîn tê hesibandin:
li cihê ku FDD tundiya floransê ye ku di kanala donor (kesk) de tê dîtin, FDA tundiya floransê ye ku di kanala qebûlker (sor) de di bin heyecana nerasterast de tê dîtin, û FAA tundiya floransê ye ku di kanala qebûlker (sor) de di bin heyecana rasterast de tê dîtin. PASTE).Di kanalê de pêlên xurtbûna floransê têne dîtin).
100 μl çareseriyên reaksiyona LLPS-ê yên ku tê de 25 μM monomerîk Tau441 (bi an bê 25 μM αS) tê de hene, têxin tamponê LLPS (wekî ku li jor hatiye pêvekirin) li ser mîkropûleyên 96-kalê yên ne-girêdayî yên bi paldanka pelê adhesive û çêbûna dilopan piştî mîkroskokî ya WF-ê hate kontrol kirin. hevsengî.di nav 10 min.Piştî 48 demjimêran ji înkubasyonê li germahiya odeyê, hebûna raft û deqên proteîn hate piştrast kirin.Dûv re bi baldarî şilava li ser raftan ji bîran derxînin, dûv re 50 L tampon veqetandinê (10 mM HEPES, pH 7.4, 1 M NaCl, 1 mM DTT) lê zêde bikin û 10 hûrdeman înkuba bikin.Kêmbûna xwê ya bilind piştrast dike ku LLPS dê ji ber PEG-ya mayî dubare nebe, û meclîsên proteîn ên gengaz ên ku tenê ji hêla danûstendinên elektrostatîk ve têne çêkirin dê werin hilweşandin.Dûv re binê bîrê bi baldarî bi tîpek mîkropîpetê hate qut kirin û çareseriya encam hate veguheztin bîrek çavdêriyê ya vala.Piştî inkubasyona nimûneyan bi 50 μM ThT ji bo 1 saetan, hebûna deqên veqetandî bi mîkroskopa WF hate kontrol kirin.Fîbrîlên αS yên sonikkirî amade bikin ku 300 μl çareseriyek αS ya 70-μM di PBS de bi pH 7,4, sodyûm azid 0,01% li 37 °C û 200 rpm li ser hejkerek orbital ji bo 7 rojan vekin.Dûv re çareserî ji bo 30 hûrdem li 9600 × g hate santrîfuj kirin, pellet di PBS pH 7.4 de ji nû ve hate sekinandin û nimûneyên fibrîl (1 hûrdem, 50% çerx, 80% amplitude di sonicatorek Vibra-Cell VC130, Sonics, Newton, USA) de hate sonik kirin. bi belavkirina mezinahiya nisbeten yekgirtî ya fibrilên piçûk.
Analîza FCS / FCCS û tespîtkirina hevrêziya du-reng (TCCD) li ser heman mîkroskopa konfokal a fluorescent a dem-çareserkirî MT200 (Pico-Quant, Berlîn, Almanya) ku ji bo ceribandinên mîkroskopê FLIM-FRET bi karanîna moda PIE ve hatî bikar anîn hate kirin.Hêza lazerê ji bo van ceribandinan li 6.0 µW (481 nm) û 6.2 µW (637 nm) hat zêdekirin.Kombûna van hêzên lazerê hate hilbijartin ku ji bo cotên fluorophoreyên ku têne bikar anîn ronahiya heman rengî hilberîne dema ku rêjeyên hejmartinê yên herî baş bi dest dixe û dûrkirina wêne û têrbûnê.Hem berhevkirina daneyan û hem jî analîz bi karanîna nermalava SymphoTime64 guhertoya 2.3 ya ku ji hêla bazirganî ve hatî peyda kirin (PicoQuant, Berlîn, Almanya) hate kirin.
Nimûneyên hevberdanên αS/Tau yên veqetandî yên ku bi karanîna LLPS-ê têne wergirtin di tamponek veqetandinê de berbi berhevbûna monomolekular a guncan ve têne rijandin (bi gelemperî 1:500 rijandin, ji ber ku berhevok jixwe dema ku ji nimûneyên hevgirtî têne veqetandin di tansiyonên kêm de ne).Nimûn rasterast li ser çîpên serpêhatî (Corning, USA) ku bi çareseriyek BSA-yê bi giraniya 1 mg / mL ve hatî pêçandî hatine bicîh kirin.
Ji bo analîza PIE-smFRET di kanalên kesk û sor de, ji bo fîlterkirina nîşaneyên tundiya nizm ên ku ji hêla bûyerên monomerî ve têne fîltrekirin, bendek tundûtûjiyê ya jêrîn a 25 fotonan hate sepandin (bala xwe bidin ku monomer ji nimûneyên berhevkirî li gorî berhevokên veqetandî zêdetir in).Ji bo ku bi taybetî berhevokên ji bo analîzê hilbijêrin, ev bend wekî pênc carî ji ziravbûna navînî ya αS monomerîk a ku ji analîzkirina nimûneyên monomer ên paqij hatî wergirtin hate hesibandin.Dora ajokera PIE, bi hev re bi wergirtina daneya TSCPC re, sepana parzûnek giraniya heyatî ya ku dibe alîkar ji holê rakirina paşnav û xaça spektral çalak kiriye.Zêdebûna şewatê ya ku bi karanîna tixûbên jorîn hatî hilbijartî bi karanîna nîşana paşnavê ya navînî ya ku ji hîstogramên rûdanê li hember tundî/bina nimûneyên tenê tampon hatî destnîşankirin hate rast kirin.Teqînên ku bi tevheviyên mezin ve girêdayî ne, bi gelemperî di şopa demê de (ji bo 1 ms) çend çîpên li pey hev dagir dikin.Di van rewşan de, benek hêza herî zêde hate hilbijartin.Ji bo analîza FRET û stoichiometric, faktora gama ku bi teorîkî diyarkirî γ (0.517) hate bikar anîn.Di hêza lazera heyecanê ya ku tê bikar anîn de, hevberdana spektral û beşdariyên heyecana rasterast neguhez in (bi ceribandinê têne destnîşankirin).Karanîn û stokîometriya FRET di teqînekê de bi vî rengî tê hesibandin.