Spas ji bo serdana Nature.com.Hûn guhertoyek gerokek bi piştgirîya CSS-ya sînorkirî bikar tînin.Ji bo ezmûna çêtirîn, em pêşniyar dikin ku hûn gerokek nûvekirî bikar bînin (an jî Moda Lihevhatinê ya di Internet Explorer de neçalak bikin).Wekî din, ji bo ku piştgirîya domdar misoger bike, em malperê bêyî şêwaz û JavaScript nîşan didin.
Sliders her slayd sê gotaran nîşan dide.Bişkojkên paş û paşê bikar bînin da ku di nav slaytan de bigerin, an jî bişkokên kontrolkerê slideyê yên li dawiyê bikar bînin da ku di her slaytê de bigerin.

317 Pêşkêşkerên lûleyên polayê zengarnegir

Tabloya pêkhatina kîmyewî ya materyalê pola zengarnegir

SPACA6 proteînek rûkalê ya spermê ye ku ji bo tevhevbûna gamet di dema nûvekirina zayendî ya mammalan de krîtîk e.Tevî vê rola bingehîn, fonksiyona taybetî ya SPACA6 kêm tê fêm kirin.Em avahiya krîstal a qada derveyî hucreyî ya SPACA6 bi çareseriyek 2.2 Å ronî dikin, proteînek du-domîn a ku ji bendek çar-bendî û β-sandwîçên mîna Ig-ê yên ku ji hêla girêdanên qas-veguhêz ve hatine girêdan eşkere dikin.Ev avahî dişibihe IZUMO1, proteînek din a fusion-girêdayî gamete, ku SPACA6 û IZUMO1 endamên damezrîner ên supermalbata proteînên girêdayî fertilîzasyonê ku li vir wekî supermalbata IST tê binav kirin, dike.Sermalbata IST bi avahîsaziyê bi girêka wê ya çar-helîx û cotek motîfên CXXC yên bi dîsulfîdê ve girêdayî ye tê destnîşan kirin.Lêgerîna AlphaFold-a bingehîn a proteoma mirovan endamên proteîn ên din ên vê supermalbatê nas kir;bi taybetî, gelek ji van proteînan di tevlihevkirina gamete de beşdar in.Struktura SPACA6 û pêwendiya wê bi endamên din ên supermalbata IST re di zanîna me ya lihevhatina gamete ya mammalan de zencîra winda peyda dike.
Jiyana her mirovî bi du gametên haploîd ên cihê dest pê dike: spermê bav û hêka dê.Ev sperm serketiya pêvajoyek hilbijartî ya tund e ku tê de bi mîlyonan hucreyên spermê di rêça zayendî ya jinê re derbas dibin, astengên cûrbecûr derbas dikin1 û di bin kapasîteyê de, ku tevgera wan û pêvajoya pêkhateyên rûkalê2,3,4 zêde dike.Ger sperm û oocyte hevûdu bibînin jî ev pêvajo hîn neqediyaye.Derdora oocyte bi qatek xaneyên kumulus û bendek glycoprotein a bi navê zona pellucida hatiye dorpêçkirin, ji bo ku sperm têkevin hundurê oocyte divê tê de derbas bibe.Spermatozoa ji bo derbaskirina van astengên dawîn tevhevek molekulên adhezyonê yên rûvî û enzîmên bi parzûnê ve girêdayî û veşartî bikar tînin5.Ev molekul û enzîm bi giranî di parzûna hundurîn û matrixa akrozomê de têne hilanîn û dema ku parzûna derve ya spermê di dema reaksiyona akrozomî de lîz dibe, têne tespît kirin6.Di vê rêwîtiya giran de gava dawîn bûyera tevhevkirina sperm-hêk e, ku tê de her du xaneyê parzûnên xwe digihînin hev û bibin organîzmek dîploîd7.Her çend ev pêvajo di hilberîna mirovî de destpêkek e, têkiliyên molekulî yên pêwîst kêm têne fam kirin.
Ji bilî fertilîzasyona gametan, kîmya hevgirtina du du qatên lîpîdê bi berfirehî hatiye lêkolîn kirin.Bi gelemperî, tevhevbûna membranê pêvajoyek enerjîk nebaş e ku pêdivî ye ku katalîzatorek proteîn bikeve guherînek pêkhatî ya avahî ya ku du membranan nêzî hev dike, berdewamiya wan dişkîne û dibe sedema fusion8,9.Van katalîzatorên proteîn wekî fusogens têne zanîn û di pergalên tevlihevkirinê yên bêhejmar de hatine dîtin.Ew ji bo ketina vîrusê di nav hucreyên mêvandar de hewce ne (mînak, gp160 di HIV-1 de, lûtkeya di coronaviruses de, hemagglutinin di vîrusên înfluensayê de) 10,11,12 placental (syncytin) 13,14,15 û di eukaryotên jêrîn de fusions-çêkirina gamete ( HAP2 / GCS1 di nebat, protîst û artropodan de) 16,17,18,19.Fusogenên ji bo gametên mirovan hîn nehatine keşif kirin, her çend çend proteîn ji bo girêdana gamete û hevgirtinê krîtîk in.CD9-a oocyte diyarkirî, proteînek transmembrane ya ku ji bo tevhevkirina gametên mişk û mirovan hewce dike, yekem bû ku hate kifş kirin 21,22,23.Her çend fonksiyona wê ya rastîn ne diyar bimîne jî, rola di adhesionê de, strukturên focên adhesionê yên li ser mîkrovilên hêkê, û / an cîhkirina rast a proteînên rûyê oocyte 24,25,26 xuya dike.Du proteînên herî tîpîk ên ku ji bo tevhevkirina gametê krîtîk in, proteîna spermê IZUMO127 û proteîna oocyte JUNO28 in, û hevgirtina wan di naskirina gamete û girêdana beriya hevgirtinê de gavek girîng e.Mişkên nêr Izumo1 ên nokaut û mêşên mê yên Juno bi tevahî sterîl in, di van modelan de sperm dikevin qada perivitelline lê gamet li hev nayên.Bi heman rengî, dema ku gametes bi antî-IZUMO1 an JUNO27,29 antîbozên di ceribandinên fertilîzasyona in vitro ya mirovî de hatin derman kirin, tevlihevî kêm bû.
Di van demên dawî de, komek proteînên ku bi spermê ve hatî vedîtin bi fenotîpîkî mîna IZUMO1 û JUNO20,30,31,32,33,34,35 ve hatî vedîtin.Proteîna 6-a-girêdayî ya membrana acrosomal a spermê (SPACA6) di lêkolînek mutagenesisa mîzê ya mezin de ji bo fertilîzasyonê pêdivî ye.Têkxistina transgeneyê di gena Spaca6 de spermatozoayên neqelibî çêdike, her çend ev spermatozoa di qada perivitelline de dikevin 36.Lêkolînên paşerojê yên li mişkan piştrast kir ku Spaca6 ji bo tevhevkirina gamete 30,32 hewce ye.SPACA6 hema hema bi taybetî di testan de tête diyar kirin û xwedan şêweyek herêmîbûnê ya mîna ya IZUMO1 heye, ango di hundurê spermatozoa de berî reaksiyona akrosomal, û dûv re jî piştî reaksiyona acrosomal 30,32 koçî herêma ekvatoriyê dike.Homologên Spaca6 di cûrbecûr mammal û eukaryotên din 30 de hene û girîngiya wê ji bo tevhevkirina gametên mirovî bi astengkirina fertilîzasyona mirovî ya li vitro bi berxwedana li dijî SPACA6 30 ve hatî destnîşan kirin.Berevajî IZUMO1 û JUNO, hûrguliyên avahî, têkilî û fonksiyona SPACA6 ne diyar in.
Ji bo baştir fêmkirina pêvajoya bingehîn a di binhevkirina spermê mirovan û hêkan de, ku dê me bikaribe pêşkeftinên pêşerojê di plansazkirina malbatê û dermankirina zayînê de agahdar bike, me lêkolînên strukturî û biyokîmyayî yên SPACA6 kir.Struktura krîstal a qada derveyî hucreyî ya SPACA6 komek çar-helîkal (4HB) û domanek mîna immunoglobulin-a (Ig-wek) ku ji hêla herêmên quasi-leaksî ve girêdayî ye nîşan dide.Wekî ku di lêkolînên berê de hate pêşbînîkirin, 7,32,37 avahiya domainê ya SPACA6 dişibihe ya IZUMO1 ya mirovî, û her du proteîn motîfek neasayî parve dikin: 4HB bi rûyek helîkî ya sêgoşeyî û cotek motîfên CXXC yên bi dîsulfîdê ve girêdayî ye.Em pêşniyar dikin ku IZUMO1 û SPACA6 naha supermalbatek mezin, bi avahî ve girêdayî proteînên ku bi tevhevkirina gamete ve girêdayî ne diyar dikin.Bi karanîna taybetmendiyên ji bo supermalbatê yekta, me lêgerînek bêkêmasî ji bo proteoma mirovî ya strukturel AlphaFold pêk anî, endamên din ên vê supermalbatê, di nav de çend endamên ku di tevhevkirina gamete û/an fertilîzasyonê de beşdar in, nas kirin.Naha xuya dibe ku qateyek avahîsaziyek hevpar û supermalbatek proteînan heye ku bi tevhevkirina gamete ve girêdayî ye, û avahiya me nexşeyek molekulî ya vê aliyek girîng a mekanîzmaya tevlihevkirina gamete ya mirovî peyda dike.
SPACA6 proteînek transmembranek yek-derbasî ye ku bi yek glycan-N-girêdayî û şeş girêdanên dîsulfîdê yên gumanbar heye (Wêne S1a û S2).Me qada derveyî hucreyî ya SPACA6 ya mirovî (bermayiyên 27-246) di şaneyên Drosophila S2 de diyar kir û proteîn bi karanîna nîkel, pevguherîna kation, û kromatografiya dûrxistina mezinbûnê paqij kir (Hêjîrê S1b).Ektodomaina SPACA6 a paqijkirî pir aram û homojen e.Analîza ku bi karanîna kromatografiya dûrxistina mezinbûnê ya ku bi belavbûna ronahiyê ya pirgonal (SEC-MALS) re hevgirtî ye, yek lûtkek bi giraniya molekulê ya hesabkirî ya 26,2 ± 0,5 kDa eşkere kir (Hêjî. S1c).Ev bi mezinahiya ektodomîna monomerî ya SPACA6 re hevaheng e, destnîşan dike ku oligomerîzasyon di dema paqijkirinê de çênebûye.Wekî din, spektroskopiya dîkroîzma dorhêlî (CD) avahiyek α/β ya tevlihev a bi xala helînê 51,3 °C eşkere kir (Hêjîrê S1d,e).Deconvolution of the spectra CD 38.6% α-helîk û 15.8% hêmanên β-stranded eşkere kir (Wêne S1d).
Ektodomain SPACA6 bi karanîna tovkirina matrixê ya rasthatî38 hate krîstalîze kirin û di encamê de komek daneya bi çareseriya 2.2 Å (Table 1 û Figure S3) derket.Bi karanîna berhevokek veguheztina molekular-based perçe û daneya qonaxkirina SAD-ê bi rûbirûbûna bromîdê re ji bo destnîşankirina strukturê (Table 1 û Figure S4), modela paşîn a paşîn ji bermayiyên 27-246 pêk tê.Di dema ku avahî hate destnîşankirin, strukturên ceribandin an AlphaFold tune bûn.Ektodomain SPACA6 20 Å × 20 Å × 85 Å dipîve, ji heft helîkan û neh xêzikên β pêk tê, û xwedan qatek sêyem a dirêjkirî ye ku ji hêla şeş bendên dîsulfîdê ve hatî stabîlkirin (Hêjî. 1a, b).Tîrêjiya elektronê ya qels a li dawiya zincîra kêlekê Asn243 destnîşan dike ku ev bermayî glycosylasyonek bi N-girêdayî ye.Avahî ji du domanan pêk tê: Pêçek çar-helîs a N-termînalê (4HB) û domanek mîna Ig-ya termînala C ya ku di navbera wan de herêmek hinge ya navîn heye (Hêjî. 1c).
Structure of the extracellular domain of SPACA6.Diyagrama strip ya qada derveyî hucreyî ya SPACA6, rengê zincîrê ji N heya C-dawiyê ji şînê tarî heya sorê tarî.Cysteinên ku di girêdanên disulfidê de beşdar dibin di magenta de têne xuyang kirin.b Topolojiya qada derveyî hucreyî ya SPACA6.Wek di Figure 1a de heman rengê rengê bikar bînin.c SPACA6 domainê derveyî hucreyî.Nexşeyên 4HB, hinge, û xêzên domanê yên mîna Ig, bi rêzê, bi rengê porteqalî, kesk û şîn in.Qat bi pîvan nayên kişandin.
Di qada 4HB ya SPACA6 de çar helîkên sereke (helîs 1-4) pêk tê, ku di şiklê helîkek helîk de hatine rêz kirin (Hêl. 2a), ku di navbera danûstendinên antîparalel û paralel de cih digirin (Hêl. 2b).Hêlîneke din a piçûk a yek-zivirînê (helîs 1′) li ser hevrêyê perpendîkuler tê danîn, sêgoşeyek bi helîkên 1 û 2 çêdike. Ev sêgoşe hinekî di pakêta helîk-zivirkirî ya pakêta nisbeten girs a helîsên 3 û 4 de hinekî deforme dibe ( Wêne 2a).
4HB N-termînal strip chart.b Dîmena jorîn a komek ji çar helîkan, her helîsek bi şînê tarî li xala N-yê û sorê tarî li dawiya C-yê ronî kirin.c Diyagrama çerxa spiral a jorîn-bi jor ji bo 4HB, ku her bermayî wekî xeleka ku bi kodek asîda amînî ya yek tîpî hatî nîşankirin tê xuyang kirin;tenê çar asîdên amînî yên li serê çerxê têne jimartin.Bermahiyên ne-polar zer têne reng kirin, bermahiyên polar ên nebarkirî kesk têne reng kirin, bermahiyên bi barkirina erênî şîn têne rengîn, û bermahiyên bi barkirina neyînî bi rengê sor têne reng kirin.d Rûyên sêgoşeyî yên domaina 4HB, bi 4HB bi porteqalî û çîpên kesk.Her du navber girêdanên dîsulfîdî yên bi şiklê rod nîşan didin.
4HB li ser naverokek hîdrofobîk a hundurîn ku bi giranî ji bermahiyên alifatîk û aromatîk pêk tê tê berhev kirin (Wêne. 2c).Navik di navbera Cys41 û Cys55 de girêdanek dîsulfîdê dihewîne ku helîkên 1 û 2 di sêgoşeya bilindkirî ya jorîn de bi hev ve girêdide (Wêne. 2d).Di navbera motîfa CXXC ya li Helix 1' û motîveke din a CXXC de du girêkên dîsulfîdê yên din ên ku li ser serê β-pêça porê li herêma hingeyê tê dîtin, hatin çêkirin (Hêjîrê. 2d).Bermahiyek argînîn a muhafezekar bi fonksiyonek nenas (Arg37) di hundurê sêgoşeya vala ku ji hêla helîkên 1', 1, û 2 ve hatî çêkirin de cih digire. Atomên karbonê yên alîfatîkî Cβ, Cγ, û Cδ Arg37 bi navika hîdrofobîk re tevdigerin, û komên wê yên guanidine bi dorhêlî diçin. di navbera helîkên 1 'û 1-ê de bi riya danûstendinên di navbera stûna Thr32 û zincîra kêlekê de (Hêjîrê S5a,b).Tyr34 di nav valahiyê de dirêj dibe du valahiyên piçûk ku bi navgîniya Arg37 dikare bi çareserkerê re têkilî daynin.
Domên β-sandwîçên mîna Ig supermalbatek mezin a proteînan e ku taybetmendiya hevpar a du an jî zêdetir pelên β-amphipathîk ên pir-zindî yên ku bi navgînek hîdrofobîk re têkildar in parve dikin. 39 û ji du qatan pêk tê (Hêjî. S6a).Berhema 1 pelek β-ya çar rêzan e (zincên D, F, H, û I) ku tê de xêzên F, H, û I lihevkirinek antî-paralel çêdikin, û xêzên I û D têkiliyek paralel digirin.Tablo 2 pelgeyek beta ya dubendî ya dijî-paralel a piçûk e (rêzikên E û G).Di navbera C-dawiya zincîra E û navenda zincîra H (Cys170-Cys226) de girêdanek dîsulfîdê ya hundurîn hate dîtin (Hêjîrê S6b).Ev girêdana dîsulfîdê mîna girêdana disulfîdê ya di qada β-sandwich a immunoglobulin40,41 de ye.
Pela β-çar-xalî li seranserê dirêjahiya xwe dizivire, keviyên asîmetrîk ên ku di şekl û elektrostatîkê de ji hev cihê dibin ava dikin.Kêra ziravtir rûxeyek hawîrdorê ya hîdrofobîk e ku li gorî rûberên nehevseng û elektrostatîkî yên cihêreng ên mayî yên li SPACA6-ê radiweste (Wêne. S6b,c).Haloyek ji komên karbonîl/amîno yên piştê yên vekirî û zincîrên aliyên polar rûxara hîdrofobîk dorpêç dike (Wêne. S6c).Perçeya firehtir ji hêla perçeyek helîkî ya sergirtî ve hatî nixumandin ku beşa N-termînalê ya navika hîdrofobîk asteng dike û bi koma polar a vekirî ya pişta zincîra F re sê bendên hîdrojenê çêdike (Hêjî. S6d).Parçeya C-termînalê ya vê qiraxê çenteyek mezin bi navikek hîdrofobîk a qismî vekirî pêk tîne.Ji ber sê komên bermayiyên argînîn ên ducar (Arg162-Arg221, Arg201-Arg205 û Arg212-Arg214) û histidine navendî (His220) dor bi barên erênî ve tê dorpêç kirin (Wêne S6e).
Navçeya hinge parçeyek kurt e di navbera qada helîkî û qada mîna Ig-ê de, ku ji yek-tebeqek β-sê-hêlî ya antîparalel (zincên A, B û C), 310 helixek piçûk, û çend beşên helîkopterî yên dirêj ên bêserûber pêk tê.(Hêjîrê S7).Tora têkiliyên kovalent û elektrostatîk ên li herêma hinge xuya dike ku rêwerziya di navbera 4HB û qada mîna Ig-ê de aram dike.Tora dikare bibe sê beşan.Beşa yekem du motîfên CXXC (27CXXC30 û 139CXXC142) vedihewîne ku di navbera tîrêjê β-hairpinê de û helika 1' di 4HB de cotek girêkên dîsulfîdê pêk tîne.Di beşa duyemîn de têkiliyên elektrostatîk ên di navbera qada Ig-mîna û hinge de pêk tê.Glu132 di hingeyê de bi Arg233 re di qada mîna Ig-ê de û Arg135 di hingeyê de pirek xwê pêk tîne.Di beşa sêyem de girêdanek kovalentî di navbera qada Ig-mîna û devera hinge de heye.Du girêkên dîsulfîdê (Cys124-Cys147 û Cys128-Cys153) girêka hingeyê bi girêdanek ve girêdidin ku ji hêla danûstendinên elektrostatîk ên di navbera Gln131 û koma fonksiyonê ya piştê de stabîl dibe, ku destûrê dide gihîştina qada yekem a mîna Ig.merbend.
Struktura ektodomîna SPACA6 û strukturên kesane yên 4HB û domên mîna Ig-ê ji bo lêgerîna tomarên wekhev ên strukturel ên di databasên proteîn 42 de hatine bikar anîn.Me pêşbirkên bi pûanên Dali Z yên bilind, veguheztinên standard ên piçûk, û pûanên mezin ên LALI nas kirin (ya paşîn hejmara bermahiyên strukturel ên wekhev e).Dema ku 10 lêdanên yekem ên ji lêgerîna tevahî ektodomîn (Tablo S1) xwedî rêjeyek Z-ya pejirandî ya > 842 bû, lêgerînek ji bo 4HB an domaina mîna Ig-ê tenê destnîşan kir ku piraniya van lêdan tenê bi β-sandwiches re têkildar in.di gelek proteînan de qateyek berbelav tê dîtin.Her sê lêgerînên li Dali tenê encamek vedigere: IZUMO1.
Demek dirêj tê pêşnîyar kirin ku SPACA6 û IZUMO1 dişibin hevsengiyên strukturel7,32,37.Her çend ektodomînên van her du proteînên hevgirêdana gametê tenê 21% nasnameya rêzê parve dikin (Wêne S8a), delîlên tevlihev, di nav de şêwazek girêdana dîsulfîdê ya parastî û domanek mîna Ig-ya C-termînalê ya pêşbînîkirî di SPACA6 de, destûr da ku hewildanên destpêkê ji bo avakirina modela homolojiya A mişkek SPACA6 ku IZUMO1 wekî şablon bikar tîne37.Avahiya me van pêşbîniyan piştrast dike û asta rastîn a wekheviyê nîşan dide.Bi rastî, strukturên SPACA6 û IZUMO137,43,44 heman mîmariya du-domain (Hêjî. S8b) bi domên β-sandwich-ê yên mîna 4HB û Ig-ê yên ku ji hêla herêmek hinge ve girêdayî ne, parve dikin (Hêjî. S8c).
IZUMO1 û SPACA6 4HB cudahiyên hevpar ên ji pakêtên spiral ên kevneşopî hene.4HB-yên tîpîk, mîna yên ku di kompleksên proteînên SNARE yên ku di tevhevbûna endozomî 45,46 de beşdar in, têne dîtin, helîkên yeksan ji hev veqetandine ku li dora kelekek navendî 47 xêzek domdar diparêzin. Berevajî vê, qadên helîkî hem di IZUMO1 û hem jî di SPACA6 de berovajî bûne, bi kêşana guhêrbar û pakkirina nehevseng (Wêne S8d).Tevlihevî, belkî ji hêla sêgoşeya ku ji hêla helîkên 1 ', 1 û 2 ve hatî çêkirin, di IZUMO1 û SPACA6 de tê parastin û ji hêla heman motîfa CXXC ve li ser helika 1'-ê hatî stabîl kirin.Lêbelê, girêdana dîsulfîdê ya zêde ya ku di SPACA6-ê de tê dîtin (Cys41 û Cys55 helîkên kovalentî 1 û 2 li jor bi hev ve girêdidin) di lûtkeya sêgoşeyê de lûtkeyek tûjtir diafirîne, ku SPACA6 ji IZUMO1-ê ziravtir dike, bi sêgoşeyên valahiyê yên diyartir.Wekî din, IZUMO1 kêmbûna Arg37-a ku di navenda vê valahiyê de li SPACA6 tê dîtin.Berevajî vê, IZUMO1 xwedan bingehek hîdrofobîk a tîpîk a bermahiyên alifatîk û aromatîk e.
IZUMO1 xwedan domanek mîna Ig-ê ye ku ji çarşefek β-qeydkirî û pênc-zirav43 pêk tê.Di IZUMO1 de zincîra zêde li şûna kulîlka SPACA6-ê digire, ku bi zengila F-yê re têkilî datîne da ku girêdanên hîdrojenê yên piştê di zincîrê de bisînor bike.Xalek balkêş a berhevdanê barkirina rûberê ya pêşbînkirî ya domên mîna Ig-ê yên du proteînan e.Rûyê IZUMO1 ji rûxara SPACA6 bi neyîniyê barkirîtir e.Xercek zêde li nêzê C-terminusê ku ber bi perdeya spermê ve tê de ye.Di SPACA6 de, heman herêm bêtir bêalî bûn an jî bi erênî barkirî bûn (Hêjîrê S8e).Mînakî, rûxara hîdrofobîk (qavên ziravtir) û qulên bi barkirina erênî (qavên firehtir) di SPACA6 de di IZUMO1 de bi neyînî têne barkirin.
Her çend têkilî û hêmanên strukturên duyemîn ên di navbera IZUMO1 û SPACA6 de baş têne parastin, lêhevkirina strukturî ya domên mîna Ig-ê destnîşan kir ku her du domîn di arastebûna xwe ya gelemperî de li gorî hev cûda dibin (Hêjî. S9).Pêla spiral a IZUMO1 li ser β-sandwichê tê xêzkirin, şeklê "bûmerangê" yê ku berê hatî behs kirin bi qasî 50 ° ji eksena navendî diafirîne.Berevajî vê, tîrêjê helîkî yê di SPACA6 de bi qasî 10 ° berevajî ve hate zivirandin.Cûdahiyên di van rêgezan de îhtîmal e ku ji ber cûdahiyên di herêma hinge de ne.Di asta rêza seretayî de, IZUMO1 û SPACA6, ji bilî cysteine, glycine, û bermahiyên aspartîk aspartîk, hevsengiya rêzikên hindik li hinge parve dikin.Wekî encamek, bendên hîdrojen û torên elektrostatîk bi tevahî cûda ne.Hêmanên avahiya duyemîn a β-pelê ji hêla IZUMO1 û SPACA6 ve têne parve kirin, her çend zincîrên di IZUMO1 de pir dirêjtir in û 310 helix (helix 5) ji SPACA6-ê re bêhempa ye.Van ciyawazî ji bo du proteînên wekî din rêgezên domainê yên cihêreng encam didin.
Lêgerîna meya servera Dali eşkere kir ku SPACA6 û IZUMO1 tenê du strukturên bi ceribandinê hatine destnîşankirin ku di databasa proteînê de hatine hilanîn ku xwedan vê qata 4HB ya taybetî ne (Table S1).Di van demên dawî de, DeepMind (Alphabet/Google) AlphaFold, pergalek bingehîn a tora neuralî ku dikare bi duristî strukturên 3D yên proteînan ji rêzikên seretayî pêşbîn bike, pêşxistiye48.Demek kin piştî ku me strukturên SPACA6 çareser kir, databasa AlphaFold hate berdan, ku modelên strukturên pêşbînbar peyda dike ku 98.5% ji hemî proteînan di proteoma mirovî de vedihewîne48,49.Bi karanîna strukturek meya SPACA6-a çareserkirî wekî modelek lêgerînê, lêgerînek homolojiya avahîsaziyê ya modelê di proteoma mirovî ya AlphaFold de berendamên ku dişibihe strukturên gengaz ên SPACA6 û IZUMO1 nas kirin.Ji ber rastbûna bêbawer a AlphaFold di pêşbînkirina SPACA6 de (Hêjî. S10a) - nemaze ektodomînaya 1.1 Å rms li gorî avahiya meya çareserkirî (Hêjî. S10b) - em dikarin pê pê bawer bin ku maçên SPACA6-ê yên naskirî rast in.
Berê, PSI-BLAST li koma IZUMO1 bi sê proteînên din ên girêdayî spermê re geriya: IZUMO2, IZUMO3, û IZUMO450.AlphaFold pêşbînî kir ku ev proteînên malbata IZUMO bi heman şêwaza girêdana dîsulfîdê ya wekî IZUMO1 (Wêne 3a û S11) di nav qada 4HB de diqelişin, her çend wan domanek mîna Ig tune be.Tê texmîn kirin ku IZUMO2 û IZUMO3 proteînên membranê yên yekalî yên mîna IZUMO1 ne, dema ku IZUMO4 xuya dike ku veşartî ye.Fonksiyonên proteînên IZUMO 2, 3, û 4 di tevlihevkirina gamete de nehatine destnîşankirin.Tê zanîn ku IZUMO3 di dema pêşkeftina spermatozoa de di biyojeneya akrozomê de rolek dileyze51, û proteîna IZUMO tevliheviyek çêdike50.Parastina proteînên IZUMO di memik, reptil û amfîbiyan de destnîşan dike ku fonksiyona wan a potansiyel bi proteînên din ên têkildar ên gamete-fusion-ê yên naskirî re, wekî DCST1/2, SOF1, û FIMP re hevaheng e.
Diagrama mîmariya domainê ya supermalbata IST, bi 4HB, hinge, û domên mîna Ig-ê, bi rêzê, bi porteqalî, kesk û şîn têne ronî kirin.IZUMO4 xwedan herêmek C-termînala bêhempa ye ku reş xuya dike.Girêdanên disulfidê yên pejirandî û yên pejirandî, bi rêzê, bi rêzikên hişk û xalî têne xuyang kirin.b IZUMO1 (PDB: 5F4E), SPACA6, IZUMO2 (AlphaFold DB: AF-Q6UXV1-F1), IZUMO3 (AlphaFold DB: AF-Q5VZ72-F1), IZUMO4 (AlphaFold DB: AF-Q6UXV1-F1) DB: AF-Q1ZYL8-F1) : AF-Q1ZYL8-F1) : AF-Q3KNT9-F1) di heman rengê rengê panelê A de têne xuyang kirin. Girêdanên dîsulfîdî bi magenta têne xuyang kirin.Helîkên transmembrane TMEM95, IZUMO2 û IZUMO3 nayên xuyang kirin.
Berevajî proteîna IZUMO, proteînên SPACA yên din (ango, SPACA1, SPACA3, SPACA4, SPACA5, û SPACA9) têne fikirîn ku ji hêla strukturî ve ji SPACA6 cûda ne (Hêjî. S12).Tenê SPACA9 xwedan 4HB ye, lê nayê pêşbînîkirin ku ew xwediyê heman rêgez-antî-paralel an jî heman girêdana dîsulfîdê ya SPACA6 be.Tenê SPACA1 xwedan domainek mîna Ig-ê ye.AlphaFold pêşbînî dike ku SPACA3, SPACA4 û SPACA5 xwedan avahiyek bi tevahî ji SPACA6 cûda ne.Balkêş e, SPACA4 jî tê zanîn ku di fertilîzasyonê de rolek dileyze, lê ji SPACA6-ê pirtir, di şûna wê de têkiliya di navbera sperm û oocyte zona pellucida52 de hêsantir dike.
Lêgerîna meya AlphaFold ji bo IZUMO1 û SPACA6 4HB, TMEM95 hevrikek din dît.TMEM95, proteînek transmembrane ya taybet a spermê ye, dema ku 32,33 were hilanîn, mişkên nêr bêzar dike.Spermatozoayên ku TMEM95 tune ne xwedî morfolojî, tevger û şiyana normal in ku derbasî zona pellucida bibin û bi perdeya hêkê ve girêbidin, lê nekarîn bi parça oocyte re bibin yek.Lêkolînên berê destnîşan kirin ku TMEM95 bi IZUMO133 re wekheviyên avahîsaziyê parve dike.Bi rastî, modela AlphaFold piştrast kir ku TMEM95 bi heman cotê motîfên CXXC yên wekî IZUMO1 û SPACA6 û heman girêdana dîsulfîdê ya zêde di navbera helîkên 1 û 2 de ku di SPACA6 de têne dîtin TMEM95 4HB ye (Hêjî. 3a û S11).Her çend TMEM95 nebûna domanek mîna Ig-ê ye, lê herêmek wê bi qalibek girêdana dîsulfîdê ya mîna herêmên girêka SPACA6 û IZUMO1 heye (Hêjî. 3b).Di dema weşandina vê destnivîsê de, servera pêş-çapkirinê avahiya TMEM95 ragihand, encama AlphaFold53 piştrast kir.TMEM95 pir dişibihe SPACA6 û IZUMO1 û ji hêla evolusyonê ve jixwe di nav amfîbîyan de tê parastin (Wêne. 4 û S13).
Lêgerîna PSI-BLAST databasên NCBI SPACA6, IZUMO1-4, TMEM95, DCST1, DCST2, FIMP, û SOF1 bikar anî da ku pozîsyona van rêzikan di dara jiyanê de diyar bike.Dûrahiya di navbera xalên şaxê de ji bo pîvanê nayên nîşandan.
Wekheviya avahiyek berbiçav a di navbera SPACA6 û IZUMO1 de destnîşan dike ku ew endamên damezrîner ên supermalbatek avahiyek parastî ne ku proteînên TMEM95 û IZUMO 2, 3, û 4 dihewîne.endamên naskirî: IZUMO1, SPACA6 û TMEM95.Ji ber ku tenê çend endam xwedan domên mîna Ig-ê ne, nîşana sermalbata IST domaina 4HB ye, ku taybetmendiyên bêhempa yên van hemî proteînan hene: 1) 4HB-ya kilkirî bi helîkên ku di alternatîfek antî-paralel/paralel de hatine rêz kirin (Hêjîrê . 5a), 2) girêk rûyek sêgoşe ye ku ji du helîkan di nav giravê de û sêyemek helîk a sêyem pêk tê (Hêjîrêka sereke (Hêjî. 5c). Motîfa CXXC, ku di proteînên mîna tîoredoksîn de tê dîtin, tê zanîn ku kar dike. wekî senzorek redoksê 54,55,56, dema ku motîfa di endamên malbata IST de dikare bi isomerazên proteîna dîsulfîdê yên wekî ERp57 ve di tevhevkirina gametê de têkildar be. Rolên 57,58 ve girêdayî ne.
Endamên supermalbata IST ji hêla sê taybetmendiyên taybetmendiyê yên qada 4HB ve têne destnîşankirin: çar helîkên ku di navbera rêgezên paralel û antîparalel de cih digirin, rûyên girêka sêgoşeyî ya ba-sêgoşe, û motîfek ducar a ca CXXC ku di navbera molekulên piçûk de pêk tê.) Helîksên N-termînalê (porteqalî) û herêma hinge β-hairpin (kesk).
Ji ber wekheviya di navbera SPACA6 û IZUMO1 de, kapasîteya berê ya ku bi IZUMO1 an JUNO ve girêdayî ye hate ceribandin.Interferometriya Biyolayer (BLI) rêbazek girêdanê ya kînetîk e ku berê ji bo pîvandina pêwendiya di navbera IZUMO1 û JUNO de hatî bikar anîn.Piştî înkubasyona senzorê bi biotin bi IZUMO1 ve wekî bazdanek bi giraniya zêde ya analytê JUNO, îşaretek xurt hate tesbît kirin (Hêjîr. S14a), ku guherînek bi girêdanê di qalindahiya biyomateriala ku bi tîpa senzorê ve girêdayî ye nîşan dide.Nîşaneyên bi vî rengî (ango, JUNO bi senzorê re wekî kelekek li dijî analîsta IZUMO1 tê girêdan) (Hêjîrê S14b).Dema ku SPACA6 wekî analîtek li dijî IZUMO1-girêdayî sensor an JUNO-girêdayî sensor hate bikar anîn ti îşaretek nehat dîtin (Wêne S14a,b).Nebûna vê nîşanê destnîşan dike ku qada derveyî hucreyî ya SPACA6 bi qada derveyî hucreyî ya IZUMO1 an JUNO re têkilî nake.
Ji ber ku ceribandina BLI li ser bingeha biotinîlasyona bermahiyên lîzînê yên belaş ên li ser proteîna baitê ye, heke bermahiyên lîzînê di têkiliyê de beşdar bibin ev guhertin dikare pêşî li girêdanê bigire.Digel vê yekê, rêgezkirina girêdanê ya bi senzorê re dikare astengiyên stêrîkî biafirîne, ji ber vê yekê vekolînên dakêşanê yên kevneşopî jî li ser ektodomên SPACA6, IZUMO1 û JUNO rekombînant hatin kirin.Digel vê yekê, SPACA6 bi IZUMO1-a-tagkirî an JUNO-ya wî-tagkirî (Wêne. S14c,d) re derneket, ku nîşan dide ku ti têkiliyek bi ya ku di ceribandinên BLI de tê dîtin tune.Wekî kontrolek erênî, me pêwendiya JUNO bi IZUMO1-a wî ya binavkirî (Wêne S14e û S15) piştrast kir.
Tevî wekheviya strukturî ya di navbera SPACA6 û IZUMO1 de, nebûna SPACA6 ku JUNO ve girêbide ne ecêb e.Li ser rûyê IZUMO1-a mirovî zêdetirî 20 bermayiyên ku bi JUNO re têkildar in, di nav wan de bermahiyên her sê deveran hene (her çend piraniya wan li herêma hinge ne) (Hêjîrê S14f).Ji van bermayiyan, tenê yek di SPACA6 (Glu70) de tê parastin.Dema ku gelek veguheztinên bermayî taybetmendiyên xwe yên biyokîmyayî yên orîjînal diparêzin, bermayiya bingehîn a Arg160 di IZUMO1 de ji hêla Asp148-a bi barkirina neyînî ve di SPACA6 de hate guheztin;lêkolînên berê destnîşan kirin ku mutasyona Arg160Glu di IZUMO1 de hema hema bi tevahî girêdana bi JUNO43 re qut dike.Digel vê yekê, cûdahiya rêgeziya domainê di navbera IZUMO1 û SPACA6 de bi girîngî qada rûbera cîhê JUNO-girêdanê ya devera wekhev a li ser SPACA6 zêde kir (Hêjîrê S14g).
Tevî hewcedariya naskirî ya SPACA6 ji bo tevhevkirina gamete û wekheviya wê ya bi IZUMO1 re, SPACA6 xwedan fonksiyonek girêdana JUNO ya wekhev xuya nake.Ji ber vê yekê, me hewl da ku daneyên xwe yên strukturel bi delîlên girîng ên ku ji hêla biyolojiya pêşkeftinê ve hatî peyda kirin re bikin yek.Rêzkirina rêzikên homologên SPACA6 parastina avahiya hevpar li derveyî memikan nîşan dide.Mînakî, bermayiyên cysteine ​​di nav amfibiyên ji dûr ve têkildar de jî hene (Wêne. 6a).Bi karanîna servera ConSurf, daneyên ragirtina hevrêziya rêzikên pirjimar ên 66 rêzikan li ser rûyê SPACA6-ê hatine nexşandin.Ev celeb analîz dikare nîşan bide ka kîjan bermahiyên di dema pêşkeftina proteînê de hatine parastin û dikare destnîşan bike ka kîjan deverên rûvî di fonksiyonê de rolek dileyzin.
Rêzkirinek rêzek ektodomên SPACA6 ji 12 cureyên cihêreng ên ku bi karanîna CLUSTAL OMEGA hatine amadekirin.Li gorî analîza ConSurf, helwestên herî muhafezekar bi şîn têne nîşankirin.Bermahiyên Cysteine ​​bi sor têne xuyang kirin.Sînorên domainê û hêmanên strukturên duyemîn li jorê rêzê têne xuyang kirin, li wir tîrêj xêzên β û pêlan helîkan destnîşan dikin.Nasnameyên Gihîştinê yên NCBI ku rêzan dihewîne ev in: mirov (Homo sapiens, NP_001303901), mandrill (Mandrilus leucophaeus, XP_011821277), meymûnê kapûçin (Cebus mimic, XP_0173593666, XP_017359380), XP_017359380, XP_0173593666, XP_0173593quus0, XP_0173593666, XP_0173593quus0, XP_017359360, hesp (2013593666) Orcinus orca3_23 XP_032_034) .), pez (Ovis aries, XP_014955560), fîl (Loxodonta africana, XP_010585293), kûçik (Canis lupus familyis, XP_025277208), mişk (Mus musculus, NP_001156manianph10), , XP_0318), Platypus, 8) , 61_89 û Bullfrog (Bufo bufo, XP_040282113).Jimarkirin li gorî rêza mirovan e.b Nûneratiya rûpî ya avahiya SPACA6 bi 4HB li jor û domaina mîna Ig li jêr, reng li ser bingeha texmînên parastinê yên ji servera ConSurf ve girêdayî ye.Parçeyên ku herî baş hatine parastin di rengê şîn de ne, beşên ku bi nermî têne parastin bi spî ne, û yên herî kêm hatine parastin di rengê zer de ne.cysteine ​​mor.Sê paçên rûkalê ku astek bilind a parastinê nîşan didin di pêlên bi etîketên 1, 2 û 3 de têne xuyang kirin. Kartonek 4HB di hundurê jorê rastê de tê xuyang kirin (eynî nexşeya rengîn).
Struktura SPACA6 xwedan sê herêmên rûberî yên pir parastî ye (Hêjîra 6b).Patch 1 4HB û herêma hinge vedihewîne û du pirên dîsulfîdê CXXC yên parastî, torgilokek Arg233-Glu132-Arg135-Ser144 (Hêjî. S7), û sê bermahiyên aromatîk ên derveyî yên parastî (Phe31, Tyr73, Phe137) vedihewîne.çemberek firehtir a domaina mîna Ig-ê (Hêjîrê. S6e), ku çend bermahiyên barkirî yên erênî li ser rûyê spermê temsîl dike.Balkêş e, ev patch epîtopek antîpodê heye ku berê hate destnîşan kirin ku bi fonksiyona SPACA6 30 re têkildar e.Herêma 3 li ser hinge û aliyek ji qada mîna Ig-ê digire;ev herêm prolînên parastî (Pro126, Pro127, Pro150, Pro154) û bermahiyên polar/barkirî yên li derve hene.Ecêb e, piraniya bermahiyên li ser rûyê 4HB pir guhêrbar in (Wêne. 6b), her çend qat li seranserê homologa SPACA6 (wek ku ji hêla muhafezekariya navika girêka hîdrofobîk ve hatî destnîşan kirin) û li derveyî supermalbata IST tê parastin.
Her çend ev di SPACA6-ê de devera herî piçûk e ku bi hindiktirîn hêmanên strukturên navîn ên diyarkirî ve girêdayî ye, gelek bermahiyên herêma hinge (di nav de devera 3) di nav homologên SPACA6 de pir têne parastin, ku dibe ku destnîşan bike ku rêgezkirina girêka helîkî û β-sandwich rolek dilîze.wek kevneperest.Lêbelê, tevî girêdana hîdrojenê ya berfireh û torên elektrostatîk ên li herêma hinge ya SPACA6 û IZUMO1, delîlên nermbûna xwerû di rêzkirina strukturên destûrdayî yên pirjimar ên IZUMO137,43,44 de têne dîtin.Rêzkirina domanên takekesî baş li hev ketine, lê arastekirina domanan bi hevûdu re ji 50° heta 70° ji teşeya navendî diguhere (Wêne. S16).Ji bo têgihiştina dînamîkên konformasyonê yên SPACA6 di çareseriyê de, ceribandinên SAXS hatin kirin (Hêjîrê S17a,b).Di destpêkê de ji nû ve avakirina ektodomîna SPACA6 li gorî avahiyek krîstal a rodê (Hêjî. S18), tevî ku nexşeya Kratky hin dereceyek nermbûnê nîşan da (Hêjî. S17b).Ev lihevhatin bi IZUMO1 re berevajî ye, ku tê de proteîna negirêdayî hem di lat û hem jî di çareseriyê de şeklê bûmerangê digire43.
Ji bo ku bi taybetî herêma maqûl nas bike, spektroskopiya girseyî ya pevguhertina hîdrojen-deuterium (H-DXMS) li ser SPACA6 hate kirin û bi daneyên berê li ser IZUMO143 (Hêjî. 7a,b) hatine berhev kirin.SPACA6 bi zelalî ji IZUMO1 maqûltir e, wekî ku piştî 100,000 s veguheztinê li seranserê avahiyê veguheztina deuteriumê ya bilindtir destnîşan dike.Di her du avahiyan de, beşa C-termînalê ya herêma hinge astek bilind a danûstendinê nîşan dide, ku belkî rê dide zivirandina tixûbdar a 4HB û domên mîna Ig-ê li gorî hevûdu.Balkêş e, beşa C-termînalê ya hingeya SPACA6, ku ji bermayiya 147CDLPLDCP154 pêk tê, herêmek pir parastî ye 3 (Wêne. 6b), belkî destnîşan dike ku nermbûna navdomain taybetmendiyek SPACA6-a ku ji hêla pêşveçûnê ve hatî parastin e.Li gorî analîza nermbûnê, daneyên helîna termal a CD nîşan da ku SPACA6 (Tm = 51,2 ° C) ji IZUMO1 (Tm = 62,9 ° C) kêmtir aram e (Hêjîrê S1e û S19).
wêneyên H-DXMS yên SPACA6 û b IZUMO1.Rêjeya danûstendina deuterium di demên diyarkirî de hate destnîşankirin.Asta danûstendina hîdrojen-deuterium bi rengek li ser pîvanek gradient ji şîn (10%) heya sor (90%) têne destnîşan kirin.Qutiyên reş deverên danûstendina bilind temsîl dikin.Sînorên 4HB, hinge û qada mîna Ig-ê ku di avahiya krîstal de têne dîtin li jor rêzika bingehîn têne destnîşan kirin.Asta pevguhertina deuteriumê di 10 s, 1000 s, û 100,000 s de li ser nexşeyek rêzikî ya ku li ser rûyên molekulî yên zelal ên SPACA6 û IZUMO1 hatî xêz kirin.Parçeyên strukturên ku asta pevguhertina deuterium di binê %50 de ne, spî ne.Deverên li jor 50% danûstendina H-DXMS di pîvanek gradient de têne reng kirin.
Bikaranîna CRISPR/Cas9 û stratejiyên genetîkî yên têkbirina genê mişkî rê li ber naskirina gelek faktorên girîng ên ji bo girêdana sperm û hêkan û hevgirtinê kiriye.Ji xeynî danûstendina baş-karakterîzekirî ya avahiya IZUMO1-JUNO û CD9, piraniya proteînên ku bi tevhevkirina gamete re têkildar in ji hêla struktur û fonksiyonel ve enigmatîk dimînin.Taybetmendiya biyofizîkî û avahî ya SPACA6 di dema fertilîzasyonê de perçeyek din a puzza molekular a adhesion/fusion e.
SPACA6 û endamên din ên supermalbata IST xuya dikin ku di mammalan de û hem jî teyrên takekesî, rewişt, û amfîbiyan pir têne parastin;Di rastiyê de, tê fikirîn ku SPACA6 ji bo fertilîzasyona li masiyên zebra 59 jî hewce ye. Ev dabeşkirin dişibihe proteînên din ên naskirî yên fusion-ê yên wekî DCST134, DCST234, FIMP31, û SOF132, û destnîşan dike ku ev faktor kêmasiya HAP2-ê jî ne wekî GCS1 tê zanîn) proteînên ku ji çalakiya katalîtîk a gelek protîstan berpirsiyar in., nebat û arthropod.Proteînên hevberdanê yên fertilîzekirî 60, 61. Tevî wekheviya strukturî ya bihêz a di navbera SPACA6 û IZUMO1 de, lêdana genên ku van proteînan kod dikin, di mişkên nêr de nefermî bû, ev nîşan dide ku fonksiyonên wan di hevgirtina gamet de dubare ne..Bi berfirehî, yek ji proteînên spermê yên naskirî yên ku ji bo qonaxa adhesionê ya fusionê hewce ne zêde ne.
Pirsek vekirî dimîne gelo SPACA6 (û endamên din ên supermalbata IST) beşdarî girêdanên navgametîk dibin, torên intragametîk ava dikin da ku proteînên girîng ji bo xalên hevgirtinê berhev bikin, an jî dibe ku wekî fusogenên nezelal tevbigerin.Lêkolînên hev-immunoprecipitation di hucreyên HEK293T de têkiliyek di navbera dirêjahiya IZUMO1 û SPACA632 de eşkere kir.Lêbelê, ektodomînên me yên rekombînant di vitro de têkilî nakin, pêşniyar dike ku têkiliyên ku di Noda et al.her du jî di avahîsaziyê de hatin jêbirin (bala xwe bidin dûvika sîtoplazmî ya IZUMO1, ku ji bo fertilîzasyonê nepêwist tê xuyang kirin62).Alternatîf, IZUMO1 û/an SPACA6 dibe ku hewceyê hawîrdorên girêdanê yên taybetî yên ku em in vitro dubare nakin, wekî konformasyonên taybetî yên fîzyolojîkî an kompleksên molekulî yên ku proteînên din hene (tê zanîn an hêj nehatine keşif kirin) hewce dike.Her çend tê bawer kirin ku ektodomîna IZUMO1 navbeynkariya girêdana spermatozoayan bi hêkê re li cîhê perivitelline dike, armanca ektodomîna SPACA6 ne diyar e.
Struktura SPACA6 gelek rûberên parastî yên ku dibe ku di danûstendinên proteîn-proteîn de beşdar bibin eşkere dike.Beşa parastî ya herêma hinge yekser li tenişta motîfa CXXC (Patch 1-ê li jor hatî destnîşan kirin) xwedan çend bermahiyên aromatîk ên li derve ne ku bi gelemperî bi têkiliyên hîdrofobîk û π-stacking di navbera biomolekulan de têkildar in.Aliyên berfireh ên qada mîna Ig-ê (herêma 2) bi Arg û bermahiyên Wî yên pir parastî ve xelekek bi bargiraniya erênî pêk tîne, û antîkorên li dijî vê herêmê berê hatine bikar anîn da ku hevgirtina gamete 30 asteng bike.Antîpoş epîtopa xêzik 212RIRPAQLTHRGTFS225 nas dike, ku sê ji şeş bermayiyên argînîn hene û His220 pir parastî ye.Ne diyar e ka ev bêfonkasyon ji ber bloka van bermahiyên taybetî ye an tevahiya herêmê ye.Cihê vê valahiyê li nêzî C-termînala β-sandwichê têkiliyên cis-têkiliyên bi proteînên spermê cîran re destnîşan dike, lê ne bi proteînên oocyte re.Digel vê yekê, ragirtina tevliheviyek pir maqûl a dewlemend-proline (malpera 3) di hundurê hinge de dibe ku cîhê têkiliyek proteîn-proteîn be an, bi îhtîmalek bêtir, girtina nermbûna di navbera her du domanan de destnîşan bike.Zayendî ji bo rola nenas a SPACA6 girîng e.tevhevbûna gametan.
SPACA6 xwedan taybetmendiyên proteînên adhezîyona navhucreyî ye, di nav de β-sandwichên mîna Ig.Gelek proteînên adhesive (mînak, cadherîn, integrîn, adhesins, û IZUMO1) xwedan yek an çend domên β-sandwich in ku proteînan ji parzûna şaneyê berbi hedefên xwe yên hawîrdorê dirêj dikin63,64,65.Qada Ig-mîna SPACA6 di heman demê de motîfek ku bi gelemperî di β-sandwîçên adhezîyon û hevgirtinê de tê dîtin jî dihewîne: dubendên zincîrên paralel ên li dawiya β-sandwîçên, ku wekî kelikên mekanîkî têne zanîn66.Tê bawer kirin ku ev motîf berxwedanê li hember hêzên rijandinê zêde dike, ku ji bo proteînên ku di danûstendinên nav-hucreyî de têkildar in bi qîmet e.Lêbelê, tevî vê wekheviya adhesins, niha tu delîl tune ku SPACA6 bi spîyên hêkan re têkilî daynin.SPACA6 ectodomain nekare bi JUNO ve girêbide, û şaneyên HEK293T yên ku SPACA6-îfade dikin, wekî ku li vir tê xuyang kirin, bi zor bi oocytes kêmbûna zona 32 re têkilî daynin.Ger SPACA6 girêdanên intergametîk damezrîne, dibe ku ev têkilî ji hêla proteînên din ên spermê ve guheztinên piştî-wergerandinê an stabîlîzasyonê hewce bikin.Ji bo piştgirîkirina hîpoteza paşîn, spermatozoa kêmbûna IZUMO1 bi oocytes ve girêdide, destnîşan dike ku molekulên ji bilî IZUMO1 di qonaxa adhesiona gamete 27 de beşdar dibin.
Pir proteînên hevberdanê yên vîrus, xaneyê, û pêşkeftinê xwedî taybetmendiyên ku fonksiyona wan wekî fusogen pêşbînî dikin hene.Mînakî, glycoproteînên fusiona vîrusê (class I, II û III) di dawiya proteînê de peptîdek fuzyonek hîdrofobîk an girêkek heye ku têxe nav membrana mêvandar.Nexşeya hîdrofîlîtiyê ya IZUMO143 û strukturê (biryar û pêşbînîkirî) ya supermalbata IST-ê peptîdek hevberdanê ya hîdrofobîk a eşkere nîşan neda.Ji ber vê yekê, heke proteînek di supermalbata IST de wekî fusogens tevbigere, ew bi rengek ji mînakên din ên naskirî cûda dikin.
Di encamê de, fonksiyonên endamên supermalbata proteînên IST yên ku bi tevhevkirina gamete ve girêdayî ne sirek dilşikestî dimîne.Molekula meya rekombînant a SPACA6 û strukturên wê yên çareserkirî dê di têkiliyên di navbera van strukturên hevbeş de û rola wan di girêdana gamete û hevgirtinê de têgihiştinê peyda bike.
Rêzeya DNA ya ku bi ektodomîna mirovî ya SPACA6 ya pêşbînîkirî re têkildar e (numreya gihîştina NCBI NP_001303901.1; bermayiyên 27-246) ji bo derbirînê di şaneyên Drosophila melanogaster S2 de kodon-optimîze bû û wekî genek bi rêzika GencomE-parçeyên KozakomEncofinkirina KozakomE ve hate sentez kirin., sînyala veşartina BiP û dawiya 5' û 3' ya têkildar ji bo klonkirina serbixwe-ligasyonî ya vê genê di vektorek îfadeya pMT de li ser bingeha promotorek metallothionein-ê ku ji bo hilbijartinê bi puromycin (pMT-puro) hatî guheztin, hatî guhertin.Vektora pMT-puro cîhek perçebûna trombînê şîfre dike û li dû wê tagek C-termînalê ya 10x-His (Wêne S2).
Veguheztina stabîl a vektora SPACA6 pMT-puro di şaneyên D. melanogaster S2 (Gibco) de bi heman rengî protokola ku ji bo IZUMO1 û JUNO43 hatî bikar anîn hate kirin.Hucreyên S2 di navgîna Schneider (Gibco) de hatin şilkirin û mezin kirin ku bi giraniya paşîn a 10% (v/v) seruma golika fetusê ya bi germê neaktîfkirî (Gibco) û antîbiyotîka antîmykotîk 1X (Gibco) lê zêde bû.Hucreyên derbasbûna destpêkê (hucreyên 3,0 x 106) di bîrên takekesî yên plakên 6-kanî (Corning) de hatin rijandin.Piştî 24 demjimêrên inkubasyonê li 27 ° C, hucre bi tevliheviyek ji 2 mg vektora SPACA6 pMT-puro û reagenta veguheztinê ya Effectene (Qiagen) li gorî protokola çêker ve hatin veguheztin.Hucreyên veguhestî 72 saetan hatin înkubakirin û paşê bi 6 mg/ml puromycinê hatin berhevkirin.Dûv re şaneyên ji navgîniya Schneider-ê ya bêkêmasî hatin veqetandin û ji bo hilberîna proteîn a mezin di navgîna Insect-XPRESS (Lonza) ya bê serum de hatin danîn.Parçeyek 1 L ya çanda şaneya S2 li şaneyên 8-10 × 106 ml-1 hate mezin kirin di firaxek Erlenmeyer a polîpropîlen a bi jêrzemînê ya 2 lîtreyî de hat hilanîn û dûv re bi giraniya dawî ya 500 μM CuSO4 (Millipore Sigma) steril kirin û sterîl hate parzûn kirin.induced.Çandinên înduksîyonî çar rojan di germahiya 27°C de di 120 rpm de hatin inkubakirin.
Navgîna şertkirî ya ku SPACA6 vedihewîne bi santrîfujasyonê li 5660 × g li 4 ° C hate veqetandin û dûv re jî pergalek parzûna herikîna tangential Centramate (Pall Corp) bi membranek 10 kDa MWCO hate veqetandin.Naveroka konsantrekirî ya ku SPACA6 vedihewîne li stûnek 2 ml Ni-NTA agarose agarose (Qiagen) bicîh bikin.Rezîna Ni-NTA bi 10 cildên stûnê (CV) tampon A hate şûştin û dûv re 1 CV tampon A hate zêdekirin da ku giraniya imidazole ya dawî ya 50 mM bide.SPACA6 bi 10 ml tampon A ya ku bi imidazole ve hatî pêvekirî heya giraniya paşîn a 500 mM hate şuştin.Trombîna sinifa sînorkirî (Milipore Sigma) rasterast li lûleya dialîzê (MWCO 12-14 kDa) bi 1 yekîneya her mg SPACA6 beramberî 1 L 10 mM Tris-HCl, pH 7.5 û 150 mM NaCl (tampon B) ji bo dialîzê hate zêde kirin.) 48 saetan li 4°C.Dûv re SPACA6-a ku bi trombîn veqetiyabû, sê qat hate rijandin da ku giraniya xwê kêm bike û li stûnek guheztina kationê ya 1 ml MonoS 5/50 GL (Cytiva / GE) ku bi 10 mM Tris-HCl, pH 7.5 hevseng e, hate barkirin.Veguhezkera kationê bi 3 OK 10 mM Tris-HCl, pH 7,5 hate şuştin, dûv re SPACA6 bi pileyek rêzik ji 0 heta 500 mm NaCl di 10 mm Tris-HCl, pH 7,5 ji bo 25 OK hate şuştin.Piştî kromatografiya pevguhertina îyonan, SPACA6 di 1 ml de hate konsantrekirin û bi isokratî ji stûnek ENrich SEC650 10 x 300 (BioRad) ku bi tampon B re hevseng bû. Li gorî kromatografê, parsên hewz û konsantretê yên ku SPACA6 dihewîne.Paqijî ji hêla elektroforez-rengkirî ya Coomassie ve li ser gêlekek 16% SDS-polyacrylamide hate kontrol kirin.Bi karanîna zagona Beer-Lambert û hevsengiya teorîkî ya windabûna molarê bi vegirtinê di 280 nm de berhevoka proteînê hate pîvandin.
SPACA6-a paqijkirî di şevekê de li hember 10 mM fosfat sodyûm, pH 7.4 û 150 mM NaF hate dîalîz kirin û berî analîzkirina bi spektroskopiya CD-yê bi 0.16 mg/ml hate rijandin.Skenandina spektral a CD-yên bi dirêjahiya pêlê ji 185 heta 260 nm li ser spektropolarimeterek Jasco J-1500 bi kuvetên quartz bi dirêjahiya riya optîkî ya 1 mm (Helma) li 25 ° C bi rêjeya 50 nm / min hate berhev kirin.Spektrên CD-ya bingehîn hatin rastkirin, li ser 10 destkeftiyan navînî hatin girtin, û di derece cm2/dmol de veguheztin elîptîsîteya mayî (θMRE):
ku MW giraniya molekulê ya her nimûneyê li Da ye;N hejmara asîdên amînî ye;θ di millidegrean de elîptîtî ye;d bi dirêjahiya riya optîkî bi cm re têkildar e;kombûna proteîn li yekîneyên.