310 10*1mm Parçeyek kîmyewî ya tubê ya polayê zengarnegir, Domên N-termînalê yên spidroin hîdrogelan li ser bingeha fîbrîlên amyloid ava dikin û platformek ji bo bêhêzkirina proteînan peyda dikin.

Spas ji bo serdana Nature.com.Hûn guhertoyek gerokek bi piştgirîya CSS-ya sînorkirî bikar tînin.Ji bo ezmûna çêtirîn, em pêşniyar dikin ku hûn gerokek nûvekirî bikar bînin (an jî Moda Lihevhatinê ya di Internet Explorer de neçalak bikin).Wekî din, ji bo ku piştgirîya domdar misoger bike, em malperê bêyî şêwaz û JavaScript nîşan didin.
Sliders her slayd sê gotaran nîşan dide.Bişkojkên paş û paşê bikar bînin da ku di nav slaytan de bigerin, an jî bişkokên kontrolkerê slideyê yên li dawiyê bikar bînin da ku di her slaytê de bigerin.

Specification

310 10*1mm dabînkerên lûleyên pêçandî yên pola zengarnegir

Pêkhatina Kîmyewî

Taybetmendiyên Mekanîkî

Proteînên hevrîşimê yên rekombînant (proteînên hevrîşimê spider) di pêşkeftina biy materyalên nû de gelek sepanên potansiyel hene, lê cewhera wan a pirmodal û mêldarê kombûnê peydakirina wan dijwar û karanîna wan hêsan dike.Li vir em radigihînin ku proteînên spidroin ên mînîtur ên rekombînant û, ya girîng, qada N-termînalê (NT) bixwe zû di 37 °C de hîdrogelên xwe-piştgir û zelal ava dikin.proteînên fusionê yên ku ji NT û proteîna fluorescent ya kesk an fosforîlaz nukleosîdê purine pêk tên proteînên fusionê yên bi tevahî fonksiyonel pêk tînin.Hydrogels.Encamên me destnîşan dikin ku proteînên NT û fusionê yên rekombînant hilberîna vegotinê ya bilind peyda dikin û hîdrogelan xwedan taybetmendiyên balkêş ên wekî şefafî, gêlkirin bêyî girêdana xaçerê, û bêhêzkirina rasterast a proteînên çalak ên di dendika bilind de peyda dikin.
Spider bi qasî heft komên cûda gewriyên hevrîşim hene, ku her yek celebek taybetî ya hevrîşimê hildiberîne.Her heft cureyên hevrîşimê ji proteînên hevrîşimê spider (spidroins) bi qasî 6000 bermayî pêk tên û herêmek dubare ya navendî ya mezin a ku ji hêla domên N- û C-termînalê yên spherîkî (NT û CT) ve hatî dorpêç kirin pêk tê.Cûreya hevrîşimê ya ku herî zêde tê lêkolîn kirin, ampula seretayî, ji hêla glanda ampula seretayî ve tê hilberandin.Di vê gewrê de, yek tebeqeya şaneyên epîtelial proteînên spidroinê çêdike û wan di nav lûmenê gêjkê de vedişêre, li wir ew bi rengek çareserker (doping) di tansiyonên pir zêde de (30-50% w/v)3,4 hene.Rêxistin û pêkvejiyana proteînên sereke yên spidroîn ên ampular ên di glandê de hatî nîqaş kirin, lê piraniya delîlên ceribandinê hebûna konformasyonek helîkî ya bi gelemperî û / an rasthatî û strukturên mîcellar an lamellar destnîşan dikin5,6,7,8,9,10.Dema ku qadên dubarekirî taybetmendiyên mekanîkî yên tîrêjên hevrîşimê birêkûpêk dikin, nanokristalên β-pel û strukturên amorf çêdikin11,12,13,14,15, domên paşîn di bersivdayîna şert û mercên guheztina li ser çîçeka hevrîşimê 16,17,18, fiberên hevrîşimê birêkûpêk dikin.Bi kontrolkirina pêkhatina hevrîşimê, 19. Domên termînalê ji hêla evolusyonê ve têne parastin û dibe ku fonksiyona wan ji hemî proteînên spidroin re hevpar be 2,20,21.Di dema derbasbûna di nav gewrê de, pH ya spidroin ji nêzîkê 7.6-ê heya <5.716-ê kêm dibe û bi veqetîn û dirêjbûnê re ku bi navbeynkariya tevgerê di nav kanala ku hêdî hêdî teng dibe re zêde dibe.Di çareseriyê de, CT dimerek paralel a pêkhatî ya α-helîkal e17, lê di berteka pH-ya kêm û hêzên şirînê de, CT-tebeqên β-16, 17 vedibe û diguherîne, belkî di herêmên dubare yên Convert 16-ê de beta-tebeqeyan çêbike. NT di bin monomer de ne. şert û mercên ku şert û mercên di lûleya rijênê de nîşan didin û navbeynkariya çareserbûna spidroinê dikin, lê di pH-ya kêm de, protonkirina hejmarek zincîrên alîgir ên asîdên karboksîlîk dibe sedema dimerîzasyona NT ya bi pKa bi qasî 6,5, bi vî rengî NT stabîl dike û spidroin di mezin de rast dike. mîqdarên.torên16,18.Ji ber vê yekê, NT di damezrandina filamentê de rolek sereke dilîze, ji monomerek di pêvekê de diguhezîne dimerek di fiber23,24,25 de.NT di bin her şert û mercên ku heya roja îro hatine lêkolîn kirin 16, 18, 19, 20, 26, 27, 28, 29, ku îlhama pêşkeftina wê wekî etîketek zêdekirina helandinê ji bo hilberîna proteînên heterologî îlhama xwe girtiye, pir çareserker û helalî dimîne.
Proteîna hevrîşimê ya mini spider a rekombînant, ku ji yek NT, yek herêmek dubare ya kurt, yek CT, û etîketek His6 (His-NT2RepCT) ji bo paqijkirinê pêk tê, di tamponek avî de bi qasî proteîna hevrîşimê ya xwecihî ya spiderê tê çareser kirin û taybetmendiyên girîng ên xwemalî yên silkê dişibîne. .vegirtin 25.31.His-NT2RepCT dikare bi karanîna makîneyek biomimetîkî ya ku tê de pêlekek helalî ya pH 8 di serşoka avê ya pH 525,32,33,34,35 de tê rijandin di nav fiberên domdar de were rijandin.Fermentasyona bioreaktorê ya E. coli ya ku His-NT2RepCT diyar dike û dûv re piştî dermankirinê di encamê de hilberîna >14 g/L piştî paqijkirinê derket.Berhema bilind, helbûna bilind, û berteka têr a His-NT2RepCT ji şert û mercên asîd re hemî ji NT23, 25, 34 re têne destnîşan kirin.
Li vir em avakirina bilez a hîdrogelên şefaf ji proteînên spidroîn ên rekombînant, tevî NT tenê, bi înkubakirina çareseriyek proteînê li 37 °C radigihînin.Bi karanîna fluorescence T thioflavin T (ThT), spektroskopiya infrared veguherîna Fourier (FTIR), spektroskopiya rezonansa magnetîkî ya nukleer (NMR) û mîkroskopiya elektronîkî ya veguheztinê (TEM), me dît ku proteînên NT û mîkrospider di veguheztina strukturel de di nav pelên β- û pelikên mîna amyloid de derbas dibin. dema gêl çêdibin.Wekî din, proteînên hevgirtinê yên NT û proteîna fluorescentê ya kesk (GFP) an fosforîlaz a nucleosîdê purine (PNP) hîdrogelan bi perçeyên tevhevkirinê yên bi tevahî fonksiyonel ava dikin.Di mêvandarên heterolog de vegotina berbelavbûna bilind, digel pêkhatina bilez a hîdrogelan di bin şert û mercên fîzyolojîk de, îhtîmala hilberîna lêçûn a hîdrogelên bi fonksiyonên endezyarkirî vedike.
Berevajî piraniya proteînên spidroîn ên rekombînant36 yên hatine ragihandin, His-NT2RepCT di tampon Tris-HCl de di pH 8 de îstîqrar e û dikare heya 500 mg/mL bêyî baranê were berhev kirin25.Ji ber vê yekê, em matmayî man ku ev proteîn dema ku di 37°C de tê înkubakirin, bi lez û bez hîdrogelên optîkî yên zelal û xwe-piştgir çêdike (Hêjîr. 1b-d).Lêkolînên din nîşan da ku gelasyona His-NT2RepCT li ser pirfirehî tansiyonên proteîn (10-300 mg / mL) pêk hat û ku ev giranî berevajî bi dema gelasyonê re têkildar bû (Wêne. 1c û Hêjmara Pêvek. 1).Ji bo ku em fêr bibin ka kîjan beşên His-NT2RepCT navbeynkariya avakirina hîdrogelê dike, me dûv re her domîn bi rengek ferdî û di navhevokên cihêreng de bi karanîna ceribandinek veguheztina flask lêkolîn kir (Wêne 1a,b).Hemî fraksîyonên ceribandinê yên spidroinê recombinant di kêmtirî 1 demjimêran de gêl ava kirin (bi giraniya proteîn a 300 mg/mL), ji bilî 2Rep-ya barkirî (Hêl. 1b).Ev pêşniyar dike ku NT û CT tenê, bi hev re, an bi dubareyan re têkildar in, dikarin li 37 °C gêl bikin û ku nîşana His6 bandorek girîng li ser vê pêvajoyê nake.Ji ber ku têgîna hevpar ku NT proteînek pir çareserker û bi îstîqrar e, û ku raporên berê yên hîdrogelên spidroîn ên rekombînant bandorên gelasyonê bi guherînên konformasyonê yên li herêmên dubare û / an CT-an ve girê didin, NT bixwe dikare.Vedîtina gelation neçaverêkirî bû.Tabloya Pêvek 1) 37, 38, 39. Bi awayekî balkêş, NT jixwe di nav 10 hûrdeman de bi giraniya ≥ 300 mg/mL (Hêjî. 1c) gêl bûye.Ceribandinên berevajîkirina vîalê bi hûrgelên cihêreng ên NT re destnîşan kirin ku li > 50 mg / mL çareseriya NT ji His-NT2RepCT zûtir gêj dibe di giraniya têkildar de (w/v, Figure 1c).
Di vê xebatê de temsîla şematîkî ya avahiyên cihêreng ên spidroinê hatine lêkolîn kirin.b Demjimêra Gel di 37 °C de ji bo cûrbecûr proteînên spidroîn ên rekombînant (300 mg/mL) bi berevajîkirina şûşê ve hatî verast kirin.CT gel yekser bêyî inkubasyonê (<300 mg/mL), 2Rep bar dike (300 mg/mL, pîvana 5 mm).c Dema Gel a His-NT2RepCT û NT li tansiyonên proteîn ên destnîşankirî li 37°C.d Wêneyên hîdrogelên His-NT2RepCT û NT yên ku spider û tîpa "NT" li jêr hatine çapkirin, bi rêzê ve (her du jî 200 mg/mL, pîvana pîvanê 5 mm).
Hîdrogelên ku ji hêla cûrbecûr proteînên spidroîn ên rekombînant ve têne çêkirin xwedan rengên hinekî cûda ne, û çavdêriya çavê rût dereceyên şefafiyê yên cihêreng nîşan dide (Hêjîra 1b).Gellên NT bi taybetî zelal in dema ku gêlên din nezelal dibin.Gellên His-NT2RepCT û NT yên ku di nav lûleyên silindrîkî de têne avêtin, dikarin ji qalibê saxlem werin derxistin (Hêjî. 1d).
Ji bo ceribandina ka gelo pêlên hevrîşimê yên siruştî gêlê di bin şert û mercên ku naha tê dîtin ku dibe sedema gêlbûna proteînên spidroinê yên vejenerîner an na, cil û bergên ji gewrê ampula mezin a spider pira swêdî (Larinioides sclopetarius) hatin berhev kirin.Kulîlk di 20 mM tampon Tris-HCl de li 50 mg/mL (li ser bingeha giraniya hişk a pîvandî) hatin hilanîn, lê di 21 roj inkubasyona li 37 °C de ti gelasyon nehat dîtin (Wêneya Pêvek 2a).
Ji bo pîvandina van gêlan, pîvandinên rheolojîk dikarin werin bikar anîn da ku pêvajoya gelasyonê lêkolîn bikin û taybetmendiyên mekanîkî yên giştî diyar bikin.Bi taybetî, çavdêriya modula hilanînê (elastîk) di germahiyên bilind de dikare li ser germahiya gelling û her weha taybetmendiyên vîskoelastîk ên cilê agahdarî peyda bike.Ceribandinên bilindbûna germahiyê (bikaranîna 1°C/min di 25-45°C de, li ser bingeha lêkolînên berê yên ku çareseriyên stokên hevrîşimê yên xwezayî bikar tînin)40,41 destnîşan kirin ku modulên hilanînê yên çareseriyên His-NT2RepCT û NT bi zêdebûna germahiyê re zêde dibin.hat zêdekirin (Hêjmara 2 û Pêvek. 3).Nemaze, modula NT li gorî His-NT2RepCT li germahiyek kêmtir dest pê kir mezin bû, digel dema gêlê ya zûtir ku tê dîtin dema ku NT rasterast bi His-NT2RepCT li 37 °C hate înkubakirin (Wêne 1).Piştî daketina dûv re di germahiyê de, modula hilanînê venegeriya nirxên jêrîn û li jor modula windabûnê ma (binêre Hêjmara Pêvek. 3), ku gêlêbûna domdar a ji hêla germî ve nayê vegerandin destnîşan dike.Piştî gelasyonê, modula elastîkê ya dawîn ji 15 heta 330 kPa ji bo hîdrogelên His-NT2RepCT bi giraniya 100-500 mg / mL, û modula elastîk a dawîn ji bo hîdrogelên NT (100-500 mg / mL) ji 2 heta 1400 bû. kPa (Hêjî, 2 û daneya rampê ya tevahî) Binêre Hêjmara Pêvek. 3).
a Guhertina germahiyê di dema pîvandina His-NT2RepCT (300 mg/mL) û b NT (300 mg/mL) bi hejandinê.Tîrik meyla germahiyê destnîşan dike, û sivikkirina siviktir a daneya modula hilanînê ceribandina li nirxên torque kêmtir ên amûrê ji ya ku ji hêla çêker ve hatî destnîşan kirin nîşan dide, ku ev yek sedema zêdebûna deng e.c Kombûna dawiya-modula His-NT2RepCT û NT piştî germahiya bilind (100, 300, û 500 mg / mL).Hemî xwendinên modulê bi frekansa 0,1 Hz têne girtin.
Wekî rêbazek potansiyel ji bo vekolîna guheztinên konformasyonê yên ku bi gelasyonê ve girêdayî ne, me spektrên FTIR yên His-NT2RepCT û NT berî û piştî gelasyonê li 37°C tomar kir (Wêne 3a,b).Wekî ku tê hêvî kirin, spektrên çareseriyên His-NT2RepCT û NT bi proteînên ku strukturek duyemîn a α-helix/hevokê rasthatî nîşan didin, bi bandek diyarkirî li 1645 cm-1 re têkildar in.Ji bo her du hîdrogelan, gelasyon bû sedema çêbûna du milan di band I-ya navîn de bi qasî 1617 cm-1 û 1695 cm-1 (Wêne. 3a, b), ku avakirina strukturên β-pelê antîparalel destnîşan dike.Ev guherandinên hanê jî dikarin bi zelalî di spektrayên gêlêkirinê yên jêderên duyemîn û cûdahiyê yên têkildar de werin dîtin (Hêjîra Pêvek. 4b).Du bandên NT β-layer ji yên His-NT2RepCT bêtir diyar bûn, ev destnîşan dike ku naveroka tevaya bandên β-layerê di hîdrogela NT de ji ya hîdrogela NT2RepCT bilindtir bû.
spektûrek vegirtinê ya FTIR ya His-NT2RepCT û b NT (hem 500 mg/mL) berî (çareseriyê) û piştî (gel) inkubasyonê li 37°C.c Wêneyên TEM-ê yên 50 mg/ml NT2RepCT gêl û d NT-ê yên ji nû ve hatine sekinandin.Barê pîvanê 200 nm.e Dîmenên fîberê yên hîdrogelên His-NT2RepCT û NT.n = 100 fîbrîlên pîvandî, p <0,0001.Barên çewtiyê veqetîna standard nîşan dide.Navenda barsên çewtiyê navgîn e.Ji bo analîza îstatîstîkî testek t-paired (du dûvik) hate bikar anîn.f ThT floransên proteînên spidroîn ên rekombînant ên cihêreng (100 mg/mL) li 37 °C bêyî hejandin.g NT (100 mg / mL) ceribandinên derzîlêdanê ji 100 mg / ml NT gel bi 0%, 5%, 10%, û 20% tov.
Analîza gêlê bi karanîna mîkroskopiya elektronîkî ya veguheztinê (TEM) nîşan da ku hîdrogel ji fîbrîlên mîna amyloid pêk tê (Hêl. 3c, 3d).Fîbrîlên NT-çêkirî dirêjkirî bûn (bi dirêjahiya 5-12 nm) û bê şax bûn, dema ku fîbrîlên His-NT2RepCT bi dirêjahî kurttir û bi pîvana girîng (7-16 nm) firehtir bûn (Hêjî. 3e).Van encaman hişt ku em bi karanîna ceribandina thioflavin T (ThT) kînetîka fibrozê bişopînin.Ji bo hemî proteînên spidroîn ên rekombînant, dema ku nimûne di 37 °C de hatin înkubakirin, sînyala fluorescent zêde bû (Hêjîrê. 3f, Hêjmara Pêvek. 5a).Li gorî vê vedîtinê, vekolîna mîkroskopî ya NT û His-NT2RepCT di bin şert û mercên gelling de zêdebûnek yekgirtî ya di fluorescence ThT-ê de bêyî berhevbûna herêmî ya berbiçav a berhevokên ThT-erênî diyar kir (Wêjeya Pêvek. 5b,c).Çêbûna fîbrîlên ThT-erênî bi zêdebûna turbidiya NT û His-NTCT re nebû (Hêjmara Pêvek. 5d), ku tê vê wateyê ku toreyek fîbrîlan di gêlê de bêyî ku tawîz bide zelaliya gel çêbibe.Tovkirina bi zêdekirina mîqdarên piçûk ên fîbrîlên pêş-çêkirî dikare bi girîngî lezkirina avakirina fibrîl a hin amîloids42,43,44 lê zêde bike 5%, 10% an 20% (w/w) NT li çareseriya hîdrokoagulantên NT.bandora tovê (Hêjîrê. 3g).Dibe ku ev ji ber vê yekê ye ku fîbrîlên di hîdrogelê de bi rêkûpêk sabît in û nekarin wekî tov werin bikar anîn.
Tevgera neçaverêkirî ya proteînên spidroin ên rekombînant di germahiyên bilind de rê li ber lêkolînên spektroskopiya rezonansa magnetîkî ya nukleerî (NMR) vekir da ku guheztinên konformasyonê yên ku bi avakirina gel re têkildar in nas bikin.Spektrên NMR yên çareseriyên His-NT2RepCT ku bi demê re di 37°C de hatine tomar kirin destnîşan kir ku CT hîn jî bi qismî hatiye pêçan, lê nîşanên NT û 2Rep winda bûne (Wêne. 4a), û destnîşan dike ku ew bi giranî NT û 2Rep bûn ku pêkhatina His- NT2RepCT hîdrogel.Nîşana CT-ê di heman demê de ji% 20 ji şiyana wê ya orîjînal hate qels kirin, û destnîşan dike ku CT jî bi piranî sabît e û di nav avahiya hîdrogelê de tête girêdan.Ji bo beşek piçûktir a CT-ê, ku bi qasî nimûneya pêş-inkubatkirî mobil e û bi vî rengî ji hêla çareseriya NMR ve tê dîtin, spektra ji bo 10 bermahiyên sazkirî yên pêşîn kêm nîşanan e, dibe ku ji ber neçalakbûna dijwar a beşa pêvekirî ya His-NT2Rep.Spektrên NMR-a rewşa hîdrogelan -NT2RepCT hebûna serdest a-helîs û b-tebeqan û, bi rêjeyek hindiktir, pêkhatina kulikê ya rasthatî eşkere kir (Hêl. 4b).Analîza veguheztina kîmyewî ya bermahiyên methionine ku tenê di NT de hene destnîşan kir ku ev domîn veguherî avahiyek β-pelê.Spektrên girêdayî demê yên NT-ê yên di çareseriyê de kêmbûnek yekreng di tundiya sînyalê de nîşan da (Hêjîrê. 4c), û NMR-ya hişk a hîdrogelên NT nîşan da ku piraniya bermayiyên NT veguherî strukturên β-pelê (Hêl. 4d).Lihevhatina 2Rep ji ber meyla wê ya berhevkirinê nekare ji hev cuda were destnîşankirin.Lêbelê, spektrên NMR-ya hişk ên hîdrogelên NTCT û His-NT2RepCT pir dişibin hev (Hêjî. 4b; Hêjmara Pêvek. 6b), destnîşan dike ku 2Rep hindik beşdarî beşa strukturî ya hîdrogela His-NT2RepCT bûye.Ji bo hîdrogelên CT-ê, α-helîs, β-pel, û strukturên navîn ên helalî yên bêserûber hatine dîtin (Hêjmara Pêvek. 6d).Ev pêşniyar dike ku hin beşên CT-ê α-helîs dimînin lê yên din dibin β-pel.Ji ber vê yekê, encamên spektroskopiya NMR destnîşan dikin ku NT ji bo damezrandina hîdrogelê girîng e û di heman demê de li ser tevhevkirina bi 2Rep û CT ve vediguhere konformasyonek β-pelê.Bi vê yekê re hevaheng, me vê dawiyê dît ku zipperên cîhê yên amyloid îhtîmal e ku di her pênc helîkên qada NT de çêbibin, û algorîtmaya Waltz herêmek amyloidogenîk di helika 1 de pêşbînî kir (Hêjî. 4e).
Spektrên 2D yên 15N-HSQC 10 mg/mL çareseriya His-NT2RepCT berî (şîn) û 19 demjimêran piştî inkubasyonê (sor) li 37°C.Di spektora sor de lûtkeyên xaçê yên takekesî û di spektora şîn de F24, G136, polyA bi sembolên asîda amînî ya yek tîp û hejmarên bermayî têne destnîşan kirin.Têkilî ji bo bermahiyên hilbijartî yên ji domên NT, 2Rep, û CT ve girêdayîbûna tundiya sînyalê bi demê re destnîşan dikin.b Spectrayên radyofrekansa rewşa hişk (RFDR) ya hîdrogelên His-NT2RepCT.Têkiliyên bermahiyên Ca/Cβ yên ku di spektrên RFDR de têne dîtin bi berhevdana bi modela veguheztinên kîmyewî yên peptîd û nirxên ku ji statîstîkên 82,83 û strukturên wan ên duyemîn hatine girtin ve hatine destnîşankirin.SSB - milê zivirî.c Spektrên yek-alî yên 15N-HSQC 10 mg/mL çareseriya NT di dema inkubasyonê de li 37 °C ji bo 36 demjimêran.Inset li gorî demê giraniya volumetric nîşan dide.d Spektrên RFDR ên rewşa hişk ên hîdrogelên NT.Têkiliyên bermahiyên Ca / Cβ û strukturên wan ên duyemîn ên ku di spekteyên RFDR de têne dîtin têne destnîşan kirin.e Li ser bingeha profîla meyldariya fibrîlasyonê ya NT45.79 ji databasa Zipper (https://services.mbi.ucla.edu/zipperdb/).Enerjiya Rosetta ya pencereya guheztina birûskê ya cîhê ya hexapeptide bi kcal/mol tê xuyang kirin.Barên sor hexapeptîdên bi meyla fibrozê ya bilind destnîşan dikin (enerjiya Rosetta di bin -23 kcal/mol; li binê xeta xalîçeyê).Barên kesk perçeyên bi enerjiyên Rosetta-yê li jor behrê nîşan didin û ji ber vê yekê hindiktir dibe ku zipperên sterîk ava bikin.Parçeyên ku proline hene ji analîzê hatin derxistin (bê stûn).Qada qadên amyloidosis ku ji hêla algorîtmaya Waltz81 (https://waltz.switchlab.org) ve hatî pêşbînî kirin destnîşan dikin.Rêzeya bermayiyên asîda amînî yên NT li jor e, û cûreyên bermahiyên ku di avahiya β ya duyemîn de têne dîtin (ji hêla spektroskopiya NMR-ya hişk ve têne destnîşankirin) bi sor têne xuyang kirin.Cihên pênc NT α-helîs wekî (H1-H5)28 têne destnîşan kirin.
Di pH <6,5 de, HT dimerize, li hember denaturasyona ku ji germê an urea hatî çêkirin re berxwedêr e18.Ji bo ku were ronî kirin ka dimerîzasyon û aramiya NT çawa bandorê li gelasyonê dike, çareseriyên ku 100 mg / ml NT dihewîne di pH 8, 7, û 6 de bi karanîna testa berevajîkirina şûşê ve hatin kontrol kirin.Nimûneyên NT di pH 8 û 7 de piştî 30 hûrdeman di 37 °C de gêl kirin, lê gêla pH 8 zelal ma, dema ku gêla pH 7 barînek xuya nîşan da (Hêjî. 5a).Berevajî vê, çareseriyek ku di pH 6 de HT heye gêl çênekir, û barek mezin piştî 20 hûrdemî di 37 ° C de tê dîtin.Ev destnîşan dike ku dimer bixwe û / an îstîqrara wan a bilindtir li gorî monomeran pêşî li gelalasyonê digire.Di pH 7 û 6 de çêbûna baranek ji bo NT-ê ne li bendê bû, ji ber ku hate ragihandin ku NT di 200 mg/ml27 de çareser dibe, piştî denaturasyona germê bi hêsanî ji nû ve vedibe, û di heman demê de di nirxên kêmtir ên a-helix de digire. pH 18. Ravekirineke muhtemel ji bo van cudahiyan ev e ku ceribandinên ku berê hatine ragihandin li germahiya odeyê an li jêr, an jî di kêşeyên proteîn ên nisbeten kêm de hatine kirin16,18,19.
Testa berevajîkirina şûşeya NT (100 mg/mL) li pH 8, 7, 6 û 154 mM NaCl (pH 8) piştî inkubasyonê li 37°C.b NT spektrên CD bi rêzê û bêyî 154 mM NaF û 154 mM NaCl.Ellipticity Molar li 222 nm veguherî beşek ji pelikên xwezayî.c Nêrîna berevajîkirina NT (100 mg/mL) NT* (37 °C û 60 °C), NTA72R (37 °C), û His-NT-L6 (37 °C û 60 °C).d spektrên CD yên mutantên NT NT*, NTA72R, û His-NT-L6.Ellipticity Molar li 222 nm veguherî beşek ji pelikên xwezayî.e Testa berevajîkirina NTFlSp, NTMiSp û NTMiSp kêmkirî (100 mg / mL).Barê pîvanê 5 mm.f spektrên CD yên NT, NTFlSp, NTMiSp û NTMiSp kêm kirin.Ellipticity Molar li 222 nm veguherî beşek ji pelikên xwezayî.Spektrên tam NT di 25 °C û 95 °C de di xêza Pêvek 8 de têne xuyang kirin.
Kêmbûna xwêya fîzyolojîkî danûstendinên elektrostatîkî yên di navbera yekîneyên NT de û dimerîzasyona veguheztina NT ya pH18 kêmtir diyar dike.Me dît ku hebûna 154 mM NaCl û NaF bi rêzê ve gelasyonê asteng dike (Wêne. 5a, b; Hêjmara Pêvek. 2b) û ku van xwê îstîqrara germî ya monomerên NT zêde dikin (Hêjîrê. 5b, Hêjmara Pêvek. 8). .Di heman demê de ew pêşniyar dike ku zêdekirina aramiyê, li şûna dimerîzasyonê, pêşî li avakirina gel digire.
Ji bo ku em rola dimerîzasyona proteînê û aramiyê di gelasyonê de bêtir lêkolîn bikin, me du mutant, NT * û NTA72R, ku di pH28.30 kêm de jî monomerîk dimînin, bikar anîn.NT* mutantek berevajîkirina barkirinê ya dualî ye ku tê de belavkirina barkêşa dupolar a xuyanî ya monomer tê xêzkirin, ku pêşî li dimerîzasyonê digire û bi tundî aramiya monomerê zêde dike.NTA72R dupolek barkirî ye, lê Alaya ku bi Arg veguherî ye li sînorê dimerî ye, ji ber vê yekê mutasyon bi danûstendinên binyekîneyê yên ku ji bo dimerîzasyonê hewce ne re têkildar e.Li ser inkubasyonê li 37 ° C, NT * hîdrogelek çênekir, dema ku NTA72R ji bo 15 hûrdeman jelek nezelal ava kir (Hêjî. 5c).Ji ber ku hem NT* û hem jî NTA72R nikarin dimerize, lê di aramiya monomerê de ji hev cihê dibin (Hêjî. 5d), ev encam bi tundî destnîşan dikin ku îstîqrara termodinamîkî ya bilind rê li ber gellkirina NT digire.Ev jî ji hêla vê rastiyê ve tê piştgirî kirin ku HT* dema ku di germahiya bilind de bêîstîqrar be (piştî 8 hûrdeman li 60°C; Fig. 5c) gêlê çêdike.Berê hate xuyang kirin ku naveroka bilind a methionine di NT de pelçiqandina wê ya xwezayî şil dike û şeş cîgirên Met to Leu (li vir wekî His-NT-L6 têne binav kirin) monomera NT46 bi hêz aram dike.Li ser bingeha texmîna ku ji bo damezrandina gela NT nermbûna strukturî hewce ye, me dît ku mutantê stabîl His-NT-L6 di 37 °C de gêl nebû (Wêne 5c, d).Lêbelê, His-NT-L6 jî li ser inkubasyonê li 60 ° C ji bo 60 deqeyan jelek çêkir (Hêjî. 5c).
Qabiliyeta NT ku veguherîne strukturên β-pelê û avakirina hîdrogelan xuya dike ku li hin lê ne hemî domên NT yên spidroinê tê sepandin.NT-yên ji cureyên hevrîşim û cureyên spider, Trichonephila clavipe (NTFlSp), tevî naveroka wan a nisbeten kêm methionine û îstîqrara germî ya bilind, gêl çêkirin (Hêjî. 5e, f û Tabloya Pêvek 2).Berevajî vê, NT ji proteîna ampular a piçûk a spidroin a Araneus ventricosus (NTMiSp) bi aramiya germî ya kêm û naveroka methionine bilind hîdrogel çênekir (Tabloya Pêvek 2 û Xiflteya 5e, f).Ya paşîn dibe ku bi hebûna girêdanên dîsulfîdî yên intramolekular re têkildar be29,47.Bi domdarî, dema ku bendên dîsulfîdê yên NTMiSp kêm bûn, piştî ku di 37°C de ji bo 10 hûrdeman sekinî hîdrogelek çêkir (Hêjîrêl 5e).Di encamnameyê de, divê were zanîn ku nermbûna strukturel pîvanek girîng e, lê ne tenê, ji bo avakirina gelek ji NT.Faktorek din a ku dibe ku têkildar be meyla avakirina fibrilên amyloidê ye, û analîza bi databasa zipper û algorîtmaya Waltz re têkiliyek di navbera şiyana çêkirina jelê û hebûna deverên amyloidogenic de, û her weha radeya deverên pêşbînîkirî nîşan dide. ji bo avakirina zippers steric.Têkiliyek hebû (Tabloya Pêvek 2 û Hêjmara Pêvek. 9).
Kapasîteya NT ku di bin şert û mercên guncan de fibrîl çêbike û jelê çêbike me rê da ku em hîpotez bikin ku hevgirtina NT bi perçeyên proteînên din re hîn jî dikarin gêl bi fonksiyona tevahî ya hevkarên fusion çêbikin.Ji bo ceribandina vê, me proteîna floransent a kesk (GFP) û purine nucleoside phosphorylase (PNP) bi rêzê li C-termînala NT destnîşan kir.Proteînên hevgirtinê yên encam di E. coli de bi hilberên dawîn ên pir bilind hatin diyar kirin (150 mg/L û 256 mg/L çandên felqê dihejîne, bi rêzê ve ji bo His-NT-GFP û His-NT-PNP), li gorî ya ku hatî destnîşan kirin. ji bo proteînên din ên ku bi NT-ê ve hatine girêdan Ref.30. His-NT-GFP (300mg/mL) û His-NT-PNP (100mg/mL) proteînên fusionê piştî 2 saet û 6,5 saetan li 37°C gêl ava kirin û ya girîng jî perçeya GFP neguherî ma.piştî gêlêkirinê tê dîtin, bi > 70% ji şiddeta floransê ya destpêkê piştî gelasyonê dimîne (Hêjîra 6a).Ji bo pîvandina çalakiya PNP-ê di çareserî û gêlên wî-NT-PNP de, me neçar ma ku proteîna fusionê bi NT-ê re bişewitînin ji ber ku çalakiya enzîmatîk a amadekirina safî li derveyî rêza tespîtê ya ceribandinê di hûrguliyên gellêdanê de bû.Gela ku bi tevliheviyek ku tê de 0,01 mg/ml His-NT-PNP û 100 mg/ml NT pêk tê 65% ji çalakiya enzîmaya destpêkê ya nimûneyên pêşinkubatkirî girtiye (Hêjî. 6b).Di dema pîvandinê de gêl saxlem ma (Hêjmara Pêvek 10).
Zehmetiya floransê ya têkildar berî û piştî gelkirina His-NT-GFP (300 mg/mL) û şûşeyek berevajîkirî ya ku hîdrogela His-NT-GFP (300 mg/mL) di bin ronahiya xuya û UV de vedihewîne.Xal pîvandinên kesane nîşan didin (n = 3), barên xeletiyê veguheztina standard nîşan didin.Nirxa navînî di navenda barên xeletiyê de tê xuyang kirin.b Çalakiya PNP bi analîzên fluorometric ve bi karanîna çareserî û jelên ku ji NT (100 mg / ml) û tevliheviyek ku 0.01 mg / ml his-NT-PNP û 100 mg / ml dolarên Taywanê yên Nû pêk tê, hate wergirtin.Kevir şûşeyek berevajîkirî nîşan dide ku tê de hîdrogelek ku tê de His-NT-PNP (barê pîvana 5 mm) tê de heye.
Li vir, em avakirina hîdrogelên ji NT û proteînên spidroîn ên din ên rekombînant bi înkubakirina çareseriyek proteînê li 37 ° C radigihînin (Wêne 1).Em nîşan didin ku gelasyon bi veguhertina α-helîceyan di nav qatên β û çêbûna fibrîlên mîna amyloidê ve girêdayî ye (Wêne. 3 û 4).Ev vedîtin sosret e ji ber ku NT girêkên globular ên pênc-helîs ên pêçandî ne ku bi helbûna xwe ya pir zêde û îstîqrara xwe ya zêde di giraniya > 200 mg/ml li 4°C de ji bo çend rojan têne zanîn27.Digel vê yekê, NT bi hêsanî piştî denaturasyona germê di mîqdarên kêm proteîn de di μM de vedibe.Li gorî encamên me, damezrandina fibril bi hevgirtinek> 10 mg/mL proteîn û germahiya piçek bilindkirî hewce dike (Wêne. 1).Ev yek bi ramana ku fibrîlên amyloid dikarin ji proteînên globular qatkirî yên ku di rewşek qismî venebûyî de ne ji ber guheztinên germî yên di bin şert û mercên fîzyolojîk de çêbibin re têkildar e 48 .Nimûneyên proteînên ku di vê veguherînê de derbas dibin însulîn49,50, β2-mîkroglobulîn, transtîretîn û lîzozim51,52,53 hene.Her çend NT di dewleta xweya xwemalî de α-helixek e, bi qasî% 65 ji zincîra polîpeptîdê bi avakirina zipperê sterîk re hevaheng e (Wêne. 4e) 45 .Ji ber ku monomer bi dînamîkî mobîl e46, ew dikare van deverên amyloidogenic ên potansiyel di germahiyên bi nermî bilind de derxîne holê û di tansiyonên bilind ên proteîna giştî de dikare ji bo avakirina fibrîl amîloidê bigihîje giraniyek krîtîk54.Li dû vê sedemê, me têkiliyek neyînî di navbera berhevdana spidroin û dema gelasyonê de dît (Wêne. 1c), û ger konformasyona NT-ya monomerîk bi mutasyon (NT*, His-NT-L6) an jî bi lêzêdekirina xwê were stabîl kirin, dikare pêşî li pêşkeftinê bigire. hîdrogelên damezrandinê (Hêjî. 5).
Di pir rewşan de, fîbrîlên amyloid ji çareseriyê wekî baranê winda dibin, lê di bin hin şert û mercan de ew dikarin hîdrogelan çêbikin55,56,57.Fîbrîlên ku hîdrogel çêdikin bi gelemperî xwedan rêjeyek awirek bilind in û bi tevlêbûna molekulî torgilokên sê-alî yên domdar ava dikin, 55,58 bi encamên me re hevaheng in.Ji bo avakirina hîdrogelê di vitro de, proteîn bi gelemperî bi tevahî an jî bi qismî vedibe, ji bo nimûne, bi rûdana rûberên organîk, germahiya bilind (70-90 ° C) û / an pH kêm (1,5-3,0) 59,60,61,62.Hîdrogelên spidroin ên ku li vir têne diyar kirin ne hewceyê pêvajoyek hişk in, ne jî ji wan re ajanên xaç-girêdan hewce ne ku hîdrogelan aram bikin.
Berê hatibû ragihandin ku spidroin dubare dike û QD-yên ku di dema rijandina hevrîşim de di bin veguheztina β-pelê de xuya dikin, hîdrogelan çêdikin.Li gorî dîtinên me, demên înkubasyonê û/an germahiyên înkubasyonê bi rêzê bi girîngî dirêjtir an bilindtir bûn, û hîdrogelên encam bi gelemperî nezelal bûn (Wêne 7 û Tabloya Pêvek 1) 37, 38, 63, 64, 65, 66, 67, 68 , 69. Ji bilî demên gêlê yên bilez, hîdrogelên NT> 300 mg/mL (30%) ji hemî hîdrogelên proteîna hevrîşimê yên rekombînant ên din ên ku hatine vegotin, û hem jî hîdrogelên xwezayî yên wekî gelatîn, algînate (2%), agar (0,5%) bi ser ketin. ) û kolajen.(0,6%) (Hêjmar 7 û Tabloyên Pêvek 1 û 3)37,39,66,67,68,69,70,71,72,73,74.
Di vê lêkolînê de dema gel û modula elastîk a hîdrogelan bi hîdrogelên din ên bingehîn ên spidroin û hîdrogelên xwezayî yên bijartî re hate berhev kirin.Referans digel ravekirina şert û mercên gelasyonê têne dayîn.APS Ammonium persulfat, germahiya odeyê.Daneyên 37, 38, 39, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74.
Wusa dixuye ku spider rêgezên xwe pêş xistine da ku pêşî li gellbûna spidroin di dema hilanînê de bigirin.Tevî tansiyona bilind a proteînê di gêrika hevrîşimê de, devera dubare ya mezin a ku bi qada termînalê ve girêdayî ye tê vê wateyê ku giraniya diyar a NT û CT di glandê de bi qasî 10-20 mg / ml, li sînorê vê lêkolînê re têkildar e.ji bo avakirina hîdrogelê ya di in vitro de pêdivî ye.Bi ser de, girseyên bi vî rengî yên xwê 16 NT stabîl kir, wekî di girêkên hevrîşimê de (Wêne. 5b).Lihevhatina NT di sîtosola E. coli de hate lêkolîn kirin û hate dîtin ku ji dema ku di in vitro de tê vekolîn zexmtir hatiye çikandin, ev jî nîşan dide ku xwê an faktorên din pêşî li kombûna wê di vivo de digirin.Lêbelê, şiyana NT-ê ku veguhezîne fibrilên β-pelê dibe ku ji bo damezrandina filamentê girîng be û divê di lêkolînên pêşerojê de were lêkolîn kirin.
Di vê lêkolînê de ji bilî aliyên nû yên damezrandina fibrîl-mîna NT-amyloid û hîdrogelê ku di vê lêkolînê de têne dîtin, em her weha destnîşan dikin ku ev diyarde dibe ku xwedan sepanên biyoteknolojî û biyobijîjkî be (Wêne. 8).Wekî delîlek têgînê, me NT bi GFP an PNP re li hev kir û destnîşan kir ku proteîna fusion di heman demê de dema ku di 37 °C de tê qut kirin hîdrogelan çêdike û ku perçeyên GFP û PNP bi giranî çalakiya xwe piştî gelasyonê diparêzin (Wêne 6).Fosforîlazên nukleozîd katalîzatorên girîng ên senteza analogên nukleozîdê ne75, ku vedîtina me ji bo pîşesaziya biyodermaceutîkî têkildar dike.Têgîna vegotina proteînên hevgirtinê yên ku di bin şert û mercên guncan de hîdrogelên şefaf çêdikin destûrê dide afirandina hîdrogelên fonksiyonelkirî yên xwedî taybetmendiyên guncan ji bo cûrbecûr sepanan ên wekî bêhêzkirina enzîmê, berdana dermanê kontrolkirî û endezyariya tevnê.Digel vê yekê, NT û NT* nîşankerên vegotinê yên bikêr in30, ku tê vê wateyê ku NT û guhertoyên wê dikarin ji bo hilberîna berbi bilind a proteînên fusionê yên çareserkirî û dûv re jî afirandina proteînên armanckirî yên bêbandor di hîdrogelên 3D de werin bikar anîn.
NT di tansiyonên nizm (μM) û 37°C de çareser dibe, α-helîkal û domdar e.Di heman germahiyê de, lê di zêdebûna tansiyonê de (> 10 mg / ml), NT gêlên ku ji fîbrîlên mîna amyloid pêk tê çêdike.Proteînên tevhevkirinê yên NT di heman demê de gêlên fîbrîlar bi perçeyên hevgirtinê yên bi tevahî fonksiyonel jî çêdikin, dihêlin ku proteînên cihêreng di hîdrogelên 3D de bi karanîna NT ve werin bêbandor kirin.Jêrîn: NT (PDB: 4FBS) û nîgarên torên fîberê û strukturên proteîn ên têkildar (tête texmîn kirin û ne li gorî pîvanê hatine kişandin, GFP PDB: 2B3Q, 10.2210/pdb2B3Q/pdb; PNP PDB: 4RJ2, 10.2pdbd21).
Avakirin (li Tabloya Pêvek 4-ê ji bo navnîşek bêkêmasî ya rêzikên asîda amînî binêre) di plasmîd pT7 de hatin klonkirin û veguheztin E. coli BL21 (DE3).E. coli ku plasmîdên endezyarî tê de hene, di şûşeya Luria ya ku bi kanamycin (70 mg/l) lê hatiye zêdekirin, hatin însulîn û şevekê di 30°C û 250 rpm de mezin bûn.Dûv re çand 1/100 di navgîna LB ya ku tê de kanamycin heye hate însulîn û di 30°C û 110 rpm de hate çandin heya ku OD600 gihîşt 0.8.Ji bo lêkolînên NMR, bakterî di navgîniya mînîmal M9 de ku tê de 2 g D-glucose 13C (Aldrich) û 1 g klorîdê amonyum 15N (Cambridge Isotope Laboratories, Inc.) vedihewîne, ji bo nîşankirina proteînan bi îzotopan ve hatin mezin kirin.Germahiya heya 20 dereceyên Celsius kêm bikin û bi 0,15 mM isopropylthiogalaktopyranoside (kûrbûna dawîn) vebêja proteîn bikin.Piştî îfadeya proteîn a şevê, hucre li 7278 × g, 4 ° C ji bo 20 hûrdeman hatin berhev kirin.Pelên hucreyê di 20 mM Tris-HCl, pH 8 de ji nû ve hatin hilanîn û heya karanîna din hatin cemidandin.Hucreyên qelandî bi karanîna astengkerek hucreyê (makîneyên rêzikên TS, Constant Systems Limited, Englandngilîztan) li 30 kPa hatin lîz kirin.Dûv re lîzat di 25,000 g ji bo 30 hûrdeman li 4°C hatin santrîfuj kirin.Ji bo NTMiSp, pellet paşê di 2 M urea, 20 mM Tris-HCl, pH 8 de ji nû ve hate sekinandin û 2 hûrdem (2 s on/off, 65%) hate sonik kirin, dûv re dîsa li 25,000 xg, 4 ° C di hundurê de hate santrîfuj kirin. 30 min.Supernatant li stûnek Ni-NTA hate barkirin, bi 20 mM Tris-HCl, 2 mM imidazole, pH 8 hate şûştin, û di dawiyê de proteîn bi 20 mM Tris-HCl, 200 mM imidazole, pH 8 hate şuştin. Ji bo afirandina NT2RepCT û NTCT, digestina trombînê malpera (ThrCleav) di navbera His û NT de destnîşan dike.Cihên perçebûna trombînê di His-NT-ThrCleav-2Rep (2Rep hildiberîne), His-thioredoxin-ThrCleav-NT (NT hildiberîne), His-thioredoxin-ThrCleav-CT (CT hilberîne), His-Thioredoxin-ThrCleav-NT jî hene. .* (NT* hildiberîne), His-Thioredoxin-ThrCleav-NTA72R (NTA72R hildiberîne), His-Thioredoxin-ThrCleav-NTFlSp (NTF1Sp hildiberîne), û His-Sulphur Redoxin-ThrCleav-NTMiSp (hilberîne).Avakirin bi trombînê (1:1000) hatin xwar û di şevekê de li 4 ° C. bi 20 mM Tris-HCl, pH 8, bi karanîna perdeya diyalîzê ya Spectra/Por bi bendek giraniya molekulî ya 6-8 kDa ve hatin dialîz kirin.Piştî dialîzê, çareserî li stûnek Ni-NTA tê barkirin û bermaya ku proteîna balkêş tê de tê berhev kirin.Pîvana proteînê bi pîvandina vegirtina UV-ê di 280 nm de bi karanîna hevsengiya hilweşandinê ya her proteînê hate destnîşankirin, ji xeynî NTF1Sp, ku li gorî protokola çêker ceribandina Bradford bikar anî.Paqijî ji hêla SDS polyacrylamide (4-20%) ve elektroforezê gel û rengkirina şîn a şîn a Coomassie ve hate destnîşankirin.Proteîn bi karanîna parzûnên santrîfujê (VivaSpin 20, GE Healthcare) di 4000 xg de bi qutkirina giraniya molekulê ya 10 kDa di 20 hûrdemên hûrdemî de hatin berhev kirin.
Çareseriya proteînê bişewitînin û 150 μl bi baldarî bipîpînin nav şûşeyek septumê ya zelal a 1 ml (8 x 40 mm Thermo Scientific).Ji bo pêşîlêgirtina evaporasyonê lûle hatin girtin û bi parafîlmê hatin girtin.Nimûne (n = 3) li 37°C an jî 60°C hatin înkubakirin û bi awayekî periyodîk hatin berevajîkirin da ku li gelalasyonê temaşe bikin.Nimûneyên ku gêl nebûne herî kêm hefteyekê hatin inkubakirin.Bi 10 mM DTT li her 10 μM proteîn girêdanên dîsulfîdê NTMiSp kêm bikin.Ji bo tehlîlkirina gêlkirina pêlên hevrîşimê yên sirûştî, spidera pira swêdî hate birîn, du girêkên sereke yên ampulkirî di nav 200 μl 20 mM Tris-HCl tampon pH 8 de hatin danîn û jêbirin da ku destûr ji çîçekan veqete..Naveroka gewrê di tamponê de, 50 µl ji bo diyarkirina giraniya hişk (bi înkubasyona fîşekên vekirî di 60 °C de heya giraniya domdar) û 150 µl ji bo gelalasyonê di 37 °C de têne hilweşandin.
Geometrî/amûra pîvandinê ji polayê zengarnegir bi karanîna lewheyek paralel a bi dirêjahiya jorîn 20 mm û valahiyek 0,5 mm tête çêkirin.Nimûneyê ji 25 °C heta 45 °C germ bikin û bi rêjeyek 1 °C di hûrdemê de bi karanîna plakaya Peltier a binê pola zengarnegir vegere 25 °C.Pîvandinên vibrasyonê bi frekansa 0,1 Hz û li herêma vîskoelastîk a xêzikî ya materyalê bi rêzdarî 5% û 0,5% ji bo nimûneyên 100 mg / mL û 300-500 mg / mL hatine kirin.Ji bo pêşîlêgirtina evaporasyonê jûreyek nermbûna xwerû bikar bînin.Daneyên bi karanîna Prism 9 ve hatî analîz kirin.
Ji bo komkirina spektrên infrared (IR) li germahiya odeyê ji 800 heta 3900 cm–1.Amûra ATR, û her weha riya ronahiyê ya di nav spektrometerê re, berî û di dema ceribandinê de bi hewaya fîlterkirî ya hişk tê paqij kirin.Çareserî (500 mg/mL ji bo kêmkirina lûtkeyên gihandina avê di spektrayan de) bi pîpetê li ser krîstalan hatin avêtin, û gêl (500 mg/mL) berî pîvandinê hatin çêkirin û dûv re veguheztin krîstalan (n = 3).1000 skanên bi rezolusyona 2 cm-1 û sifir çerxa peywirê 2 hatin tomarkirin. Derîvana duyemîn bi karanîna OPUS (Bruker) bi rêjeyek nermkirinê ya neh xalan hate hesibandin.Spectra bi karanîna F. Menges "Spectragryph - Optical Spectroscopy Software" di navbera 1720 û 1580 cm-1 de li heman devera entegrasyonê normal bûn.Di spektroskopiya ATR-IR de, kûrahiya ketina tîrêjek infrasor a nav nimûneyekê bi jimareya pêlê ve girêdayî ye, û di encamê de di jimareyên pêlên kêmtir de ji jimareyên pêlên bilindtir vegirtinek bihêztir dibe.Ev bandor ji bo spektrên ku di Hêjîrê de têne xuyang kirin nehatine rast kirin.3 ji ber ku ew pir piçûk in (Hêjmara Pêvek. 4).Spektrên rastkirî yên ji bo vê hejmarê bi karanîna nermalava Bruker OPUS ve hatin hesibandin.
Di prensîbê de, jimareyek berfireh a konformasyonên proteînan piştî hilweşandina pêbawer a pêkhateyên di nav lûtkeya amide I de gengaz e.Lêbelê, di pratîkê de hin astengî derdikevin.Dengê di spektrumê de dikare wekî lûtkeyên (derewîn) di dema dekonvolasyonê de xuya bibe.Wekî din, lûtkeya ji ber guheztina avê bi pozîsyona lûtkeya amide I re hevûdu ye û dibe ku ji bo nimûneyên ku gelek av tê de hene, wek gêla avî ku li vir hatî lêkolîn kirin, mezinahiyek wusa hebe.Ji ber vê yekê, me hewl neda ku em lûtkeya amide I bi tevahî hilweşînin, û çavdêriyên me tenê ji bo piştgirîkirina rêbazên din ên wekî spektroskopiya NMR têne hesibandin.
Çareseriyên 50 mg/ml NT û His-NT2RepCT di şevekê de di 37°C de hatin gel kirin.Dûv re hîdrogel bi 20 mM Tris-HCl (pH 8) bi giraniya 12,5 mg/ml hate rijandin, baş hat hejandin û ji bo şikandina gêlê bi pîpet hat avêtin.Dûv re, hîdrogel 10 caran bi 20 mM Tris-HCl (pH 8) hate rijandin, 5 μl ji nimûneyê li tora sifir a bi formvar hatî pêçandî hate sepandin, û nimûneya zêde bi kaxezê blotê hate rakirin.Nimûne du caran bi 5 μl ava MilliQ hatin şûştin û 5 hûrdeman bi 1% uranyl formate hatin rijandin.Bi kaxezek vegirtinê lekeya zêde jê bikin, dûv re tevna bi hewa hişk bikin.Wêneyên li ser van toran bi karanîna FEI Tecnai 12 Spirit BioTWIN-ê ku di 100 kV de dixebite hate çêkirin.Wêneyên bi x 26,500 û x 43,000 mezinkirin bi karanîna kamera Veleta 2k × 2k CCD (Olympus Soft Imaging Solutions, GmbH, Münster, Almanya) hatine tomar kirin.Ji bo her nimûne (n = 1), 10-15 wêne hatin tomar kirin.ImageJ (https://imagej.nih.gov/) ji bo analîzkirina wêneyê û pîvandina pîvanên fîberê (n = 100, fiberên cûda) hate bikar anîn.Prism 9 hate bikar anîn ku ceribandinên t-pairkirî (du dûvik) pêk bînin.Navgîniya fîbrîlên His-NT2RepCT û NT bi rêzdarî 11.43 (SD 2.035) û 7.67 (SD 1.389) nm bûn.Navbera pêbaweriyê (95%) -4.246 ber -3.275 e.dereceyên azadiyê = 198, p <0,0001.
80 μl nimûneyên şil ên ku tê de 10 μM thioflavin T (ThT) hene sê caran (n = 3) di bin şert û mercên statîk de bi karanîna tabloyên binê reş ên binê reş ên Corning 96-baş (Corning Glass 3881, USA) hatin pîvandin.Cûdahiyên floransê bi karanîna parzûnek heyecanê ya 440 nm û parzûnek belavbûna 480 nm (FLUOStar Galaxy ji BMG Labtech, Offenburg, Almanya) hatin tomar kirin.Nîşana ThT ne têr bû û ne jî qut bû, ji ber ku ceribandinên bi tansiyonên cihêreng ên ThT-ê bêyî guheztina tundiya nîşanê hatin kirin.Di 360 nm de ji bo pîvandina haze vegirtinê tomar bikin.Ji bo ceribandinên tovkirinê, 100 mg/mL gêl li 37° C. hatin çêkirin, ji nû ve hatin hilanîn, û ji bo tovkirinê bi rêjeyên molar ên 5%, 10%, û 20%.Daneyên bi karanîna Prism 9 ve hatî analîz kirin.
Parzûnên His-NT2RepCT û NT> 100 mg/mL li ser qeşayê bihelînin û bi parzûnek 0,22 μm parzînin.Bi pîvandina vegirtinê di 280 nm de bi karanîna Nanodrop ve hûrbûn têne hesibandin.Di bîrên 96-kaniyên lewheyek negirêdayî reş de (Corning) bi binî zelal, nimûne bi 20 mg/ml di 20 mM Tris-HCl pH 8 de hatin rijandin û bi 5 μM ThT (kûrbûna dawîn), tevheviya nimûneyê re tevlihev kirin. 50 μl volume.Nimûne her 10 hûrdeman di 37 °C de li ser mîkroskopa CellObserver (Zeiss) bi kanala ronahiya veguhestî û FITC fîlterên heyecan û emîsyonê ji bo wênekirina ThT hatine kişandin.Ji bo wênekêşandinê lensek 20x/0.4 tê bikaranîn.Zen Blue (Zeiss) û ImageJ (https://imagej.nih.gov/) ji bo analîzkirina wêneyê hatine bikar anîn.Ji çareseriyên NT û His-NT2RepCT jî gêl bi giraniya 50 mg/ml ku tê de 20 mM Tris pH 8 û 5 μM ThT tê de hatine amade kirin û li 37°C ji bo 90 hûrdeman inkubasyon kirin.Parçeyên gêlê hatin veguheztin bo bîrek nû ya ku tê de 20 mM Tris, pH 8, û 5 μM ThT tê de di çarşefa binê reş a ne-girêdayî ya 96 baş zelal.Di mezinbûna 20x/0.4 de floransên kesk û wêneyên zeviyê geş bistînin.ImageJ ji bo analîzkirina wêneyê hate bikar anîn.
Spektrên NMR-a Çareserî li 310 K li ser 600 MHz Bruker Avance Neo spektrometerek ku bi QCI Quadrupole Resonance Pulsed Gradient Field Cryoprobe (HFCN) ve hatî peyda kirin.Nimûneyên NMR yên ku 10 mg/mL proteîna homojen a bi 13C, 15N nîşankirî ne, di 20 mM Tris-HCl (pH 8), 0.02% (w/v) NaN3, 5% DO (v/v), (n = 1) de tê helandin. .Guhertinên kîmyewî yên NT2RepCT di pH 6.7 de ji bo destnîşankirina lûtkeya 23-ê di spektruma 2D ya 15N-HSQC de hate bikar anîn.
Goşeya efsûnî ya ku spektrayên NMR-ya zexm (MAS) yên 13C, hîdrogelên bi 15N dizivire, li ser spektrometerek Bruker Avance III HD li 800 MHz ku bi sondayek bê elektron 3,2 mm 13C/15N{1H} ve girêdayî ye, hatine tomar kirin.Germahiya nimûneyê bi karanîna herikîna gazê ya germahiya guhêrbar li 277 K hate kontrol kirin. Li frekansên MAS yên 12,5 kHz û 20 kHz, rezonansa zivirîna dualî (DARR) 76 û vegirêdana frekansa radyoyê (RFDR) 77, bi rêzê ve hatin bidestxistin.Polarîzasyona xaçê (CP) ji 1H heta 13C bi karanîna rampek xêzik ji 60.0 ber 48.0 kHz li 1H, 61.3/71.6 kHz li 13C (li 12.5/20 kHz MAS) û dema têkiliyê 0.5-1 ms hate kirin.Di berhevkirina daneyan de veqetandina Spinal6478 li 73,5 kHz hate bikar anîn.Dema wergirtinê 10 milîsaniye û derengiya dewrê jî 2,5 saniye bû.Têkiliyên Ca/Cβ yên yek-girêdayî yên ku di spektrên RFDR de têne dîtin li ser bingeha veguheztinên kîmyewî yên celeb-bermayî yên taybetmendî û têkiliyên pir-girêdayî yên di spekteyên DARR de hatine destnîşankirin.
Databasa Zipper79 (https://services.mbi.ucla.edu/zipperdb/) ji bo NT, NTFlSp, û NTMiSp nirxandina meylên flutterê û enerjiya Rosetta-yê hate bikar anîn.Databasa Zipper Rosetta Energy80-ê hesab dike, ku çend fonksiyonên enerjiyê yên belaş berhev dike da ku struktura proteîn model û analîz bike.Asta enerjiyê -23 kcal/mol an kêmtir nîşana meyla bilind a fibrîlasyonê dide.Enerjiya jêrîn tê wateya îstîqrara zêdetir a du xêzên β-ya di konformasyona zipperê de.Wekî din, algorîtmaya Waltz ji bo pêşbînkirina herêmên amyloidogenic li NT, NTFlSp û NTMiSp Ref.81. (https://waltz.switchlab.org/).
Çareseriya proteîna NT di pH 5.5 û 6.0 de bi tampon 2-(N-morfolîno) asîda etansulfonîk (MES) re hate tevlihev kirin da ku pH bi rêzdarî pH dakeve 6 û 7.Giraniya proteîna paşîn 100 mg / ml bû.
Pîvandin li ser spektrometerek CD-ya J-1500 (JASCO, USA) bi kuvetek 300 μL bi rêyek optîkî ya 0,1 cm ve hate kirin.Proteîn bi 10 μM (n = 1) di tampon fosfatê ya 20 mM de (pH 8) hatin rijandin.Ji bo analîzkirina îstîqrara proteînê di hebûna xwê de, proteîn di heman giraniyê de (n = 1) di tampon fosfatê ya 20 mM (pH 8) de ku bi rêzê ve 154 mM NaF an NaCl vedihewîne, hatin analîz kirin.Germahiya di 222 nm de ji 25 ° C heta 95 ° C bi rêjeya germkirinê ya 1 ° C / min ve hatî tomar kirin.Rêjeya proteînên xwemalî yên pêçandî bi formula (KDmeasure - KDfinal)/(KDstart - KDfinal) hate hesibandin.Wekî din, ji bo her nimûneyek ji 260 nm heta 190 nm li 25 ° C û piştî germkirina 95 ° C, pênc spektra hatin tomar kirin.Pênc spektra navîn, nerm kirin û veguheztin elîptîsîteya molarê.Daneyên bi karanîna Prism 9 ve hatî analîz kirin.
Zêdebûna floransê ya His-NT-GFP (300 mg/mL, 80 µL) sê caran (n = 3) di lewheyên Corning ên 96-kaniyê de bi binê reş û zelal (Corning Glass 3881, USA) di bin şert û mercên statîk de hate pîvandin.Nimûneyan bi xwendevanek plakaya-based fluorescence bi dirêjahiya pêla heyecanê 395 nm bipîvin û emîsyonê li 509 nm berî gêlkirinê û 2 demjimêran şûnda di 37°C de tomar bikin.Daneyên bi Prism 9 ve hatin analîz kirin.
Li gorî rêwerzên çêker, kîtê azmûna çalakiya nucleosîd fosforîlaz a purine (rêbaza fluorometric, Sigma Aldrich) hate bikar anîn.Ji bo pîvandina çalakiya di jel û çareseriyên ku His-NT-PNP hene, 10 ng His-NT-PNP bi 100 mg/mL NT re bi qebarek giştî 2 μL tevlihev bikin ji ber ku jelê li jor navbera tespîtê ya setê îşaretek da.Kontrolên ji bo gel û çareseriyên bêyî His-NT-PNP hatin girtin.Pîvan du caran hatin kirin (n = 2).Piştî ku çalakî hate pîvandin, tevliheviya reaksiyonê hate rakirin û gêl wêneyek hate kişandin da ku pê ewle bibe ku gel di dema pîvandinê de sax bimîne.Daneyên bi karanîna Prism 9 ve hatî analîz kirin.
Ji bo bêtir agahdarî li ser sêwirana lêkolînê, li kurteya lêkolîna xwezayê ya ku bi vê gotarê ve girêdayî ye binêre.
Wêneyên 1 û 2 daneyên destpêkê pêşkêş dikin.1c, 2a–c, 3a, b, e–g, 4, 5b, d, f, û 6, Hêjîrên Pêvek.3, hêjîra pêvek.5a, d, hêjîra pêvek.6 û hêjîra pêvek.8. Daneyên Daneyên vê lêkolînê di databasa Zenodo https://doi.org/10.5281/zenodo.6683653 de cih digirin.Daneyên NMR-ê yên ku di vê lêkolînê de hatine bidestxistin di bin navnîşana navnîşana bmrbig36 de li depoya BMRBig hatine şandin.Avahiyên GFP û PNP ji PDB (GFP 2B3Q, PNP 4RJ2) hatin girtin.
Rising, A. and Johansson, J. Spinning spider silk sûnî.Kîmyewî ya Neteweyî.jîyanzanî.11, 309–315 (2015).
Babb, PL et al.Genoma Nephila clavipes cihêrengiya genên hevrîşimê spider û îfadeya wan a tevlihev ronî dike.Genette Neteweyî.49, 895–903 (2017).